التصوير المجهري متعدد الفوتونات: تقنيات متنوعة لتصوير الخلايا العصبية في الجسم الحي
مقارنة بالمجهر التقليدي ذي المجال الواسع أحادي الفوتون ، فإن الفحص المجهري متعدد الفوتونات (MPM) له وظائف التقسيم البصري والتصوير العميق. في عام 2019 ، جيروم ليكوك وآخرون. ناقش تقنية MPM ذات الصلة من ثلاثة جوانب: تصوير الخلايا العصبية في أعماق الدماغ ، وتصوير الخلايا العصبية الضخمة ، وتصوير الخلايا العصبية عالي السرعة.
من أجل ربط نشاط الخلايا العصبية بالسلوك المعقد ، من الضروري عادةً تصوير الخلايا العصبية في القشرة العميقة ، الأمر الذي يتطلب أن يكون لدى MPM القدرة على التصوير العميق. سوف يتناثر ضوء الإثارة والانبعاث بشدة ويمتص بواسطة الأنسجة البيولوجية ، وهو العامل الرئيسي الذي يحد من عمق التصوير في MPM. على الرغم من أنه يمكن حل مشكلة التشتت عن طريق زيادة كثافة الليزر ، إلا أنها ستؤدي إلى مشاكل أخرى ، مثل حرق العينة ، وإزالة التركيز ، وإثارة الفلورسنت القريبة من السطح. أفضل طريقة لزيادة عمق التصوير MPM هي استخدام أطوال موجية أطول كضوء إثارة.
بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للتصوير ثنائي الفوتون (2P) ، فإن الإثارة خارج التركيز والإثارة شبه السطحية هي أكبر عاملين محددين للعمق ، بينما بالنسبة للتصوير ثلاثي الفوتون (3P) ، يتم تقليل هاتين المشكلتين بشكل كبير ، ولكن تصوير ثلاثي الفوتون بسبب التألق المقطع العرضي للامتصاص للمجموعة أصغر بكثير من المقطع العرضي للامتصاص 2P ، لذلك يلزم ترتيب طاقة نبضة أعلى للحصول على نفس كثافة إشارة التألق التي تثيرها 2P. يعتبر الفحص المجهري الوظيفي 3P أكثر تطلبًا من الفحص المجهري الهيكلي 3P ، والذي يتطلب مسحًا أسرع من أجل أخذ عينات من النشاط العصبي في الوقت المناسب ؛ مطلوب طاقة نبضية أعلى من أجل جمع إشارات كافية خلال وقت السكون لكل بكسل.
غالبًا ما تتضمن السلوكيات المعقدة شبكات دماغية كبيرة ذات اتصالات محلية وطويلة المدى. لربط نشاط الخلايا العصبية بالسلوك ، من الضروري مراقبة نشاط الخلايا العصبية الكبيرة جدًا والموزعة على نطاق واسع في نفس الوقت. تعالج الشبكة العصبية في الدماغ المنبهات الواردة في غضون عشرات من الألف من الثانية. لفهم هذه الشبكة العصبية السريعة لدراسة ديناميات الخلايا العصبية ، يجب أن يكون MPM لديه القدرة على تصوير الخلايا العصبية بسرعة. يمكن تقسيم طرق MPM السريعة إلى تقنيات مسح أحادي الحزمة وتقنيات مسح متعدد الحزم.
تتيح تقنية المسح أحادي الحزمة اجتياز الأنسجة العصبية بسرعة عالية مع مجال رؤية كبير (FOV)
عند استخدام MPM لصور الخلايا العصبية ، يمكن لمسح الوصول العشوائي - أي يتم مسح شعاع الليزر ضوئيًا بسرعة في أي نقطة محددة في مجال الرؤية بالكامل - مسح الخلايا العصبية ذات الأهمية فقط ، والتي لا تتجنب فقط مسح أي ألياف عصبية غير مسماة يمكنها أيضًا تحسين وقت مسح شعاع الليزر. يمكن تحقيق مسح الوصول العشوائي (الشكل 1) باستخدام انحراف صوتي بصري (AOD) ، والذي يعمل عن طريق ربط محول كهرضغطية بإشارة تردد راديوي بلورة مناسبة. تحفز الموجات الصوتية الناتجة محزوز معامل الانكسار الدوري ، ويحدث الانعراج عندما يمر شعاع الليزر عبر محزوز. يمكن ضبط شدة وتردد الموجة الصوتية بواسطة إشارة تردد الراديو الكهربائية لتغيير شدة واتجاه الضوء المنعرج ، بحيث يمكن تحقيق مسح نقطي أفقي أحادي البعد باستخدام AOD واحد ، ويمكن تحقيق ثلاثي الأبعاد باستخدام زوج من AODs جنبًا إلى جنب مع تقنيات المسح المحوري الأخرى ، مسح الوصول العشوائي. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية حساسة جدًا لحركة العينة وعرضة للقطع الأثرية المتحركة. في الوقت الحالي ، يتم استخدام المسح النقطي السريع ، أي المسح التدريجي في FOV ، على نطاق واسع لأن الخوارزمية يمكن أن تحل بسهولة القطع الأثرية المتحركة.
التصوير ثنائي الفوتون القائم على AOD للخلايا العصبية L2 / 3 القشرية الحديثة في الجسم الحي [2]
هناك العديد من الطرق لتحقيق المسح النقطي السريع ، وذلك باستخدام مرآة اهتزازية للمسح السريع ثنائي الأبعاد ، والجمع بين مرآة اهتزاز وعدسة كهربائية قابلة للتعديل لإجراء مسح سريع ثلاثي الأبعاد ، ولكن لا يمكن للعدسة الكهربائية القابلة للتعديل التركيز بسرعة في الاتجاه المحوري بسبب محدودية يمكن الآن استبدال تبديل القصور الذاتي الميكانيكي ، الذي يؤثر على سرعة التصوير ، بمُعدِّل الضوء المكاني (SLM).
يُعد التركيز عن بُعد أيضًا وسيلة لتحقيق التصوير ثلاثي الأبعاد ، كما هو موضح في الشكل 2. في وحدة LSU ، تقوم وحدة قياس الجلفانومتر المسح بمسح أفقيًا ، وتشمل وحدة ASU العدسة الموضوعية L1 والمرآة M ، ويتحقق المسح المحوري عن طريق الضبط موضع M. لا تستطيع هذه التقنية تصحيح الانحراف البصري الناتج عن العدسة الموضوعية الرئيسية L2 فحسب ، بل يمكنها أيضًا تمكين المسح المحوري السريع. للحصول على مزيد من التصوير للخلايا العصبية ، يمكن تكبير FOV عن طريق تعديل تصميم العدسة الموضوعية للمجهر ، لكن العدسة الموضوعية ذات NA الكبير و FOV الكبير عادة ما تكون ثقيلة ولا يمكنها التحرك بسرعة للمسح المحوري السريع ، لذلك تعتمد أنظمة FOV الكبيرة على Telefocus ، SLM وعدسات آلية قابلة للتعديل.
رسم تخطيطي لنظام تصوير ثنائي الفوتون بؤري عن بُعد [3] يمكن لتقنية المسح متعدد الحزم تصوير مواضع مختلفة للأنسجة العصبية في وقت واحد
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>مواقع التصوير بمسافة 1-2 مم) (الشكل 3 ج ، د) ؛ بالنسبة للمناطق المجاورة ، فإنه يستخدم عادة حزم متعددة من عدسة موضوعية واحدة للتصوير (الشكل 3E ، F). يجب أن تولي تقنية المسح متعدد الحزم اهتمامًا خاصًا بمشكلة الحديث المتبادل بين حزم الإثارة ، والتي يمكن حلها عن طريق طريقة فصل مصدر ما بعد الضوء أو طريقة تعدد إرسال الزمكان. تشير طريقة فصل مصدر الضوء اللاحق إلى استخدام الخوارزميات لفصل الحزم للتخلص من الحديث المتبادل ؛ تشير طريقة تعدد الإرسال في المكان والزمان إلى الاستخدام المتزامن لحزم الإثارة المتعددة ، وتتأخر نبضات كل حزمة في الوقت المناسب ، بحيث يمكن فصل الحزم الفردية المستثارة بواسطة حزم مختلفة مؤقتًا. إشارة الفلورسنت. يمكن تصوير المزيد من الخلايا العصبية عن طريق إدخال المزيد من الحزم ، ولكن الحزم المتعددة ستزيد من تداخل زمن اضمحلال التألق ، مما يحد من القدرة على التمييز بين مصادر الإشارة ؛ وتعدد الإرسال له تأثير سلبي على سرعة عمل الأجهزة الإلكترونية. متطلبات عالية يتطلب عدد كبير من الحزم أيضًا طاقة ليزر أعلى للحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء تقريبية لشعاع واحد ، مما قد يؤدي بسهولة إلى تلف الأنسجة.
تقنية تصوير المنطقة الكبيرة
في السنوات الأخيرة ، أدى تطوير تقنيات MPM المختلفة إلى توسيع نطاق تصويرنا للأنسجة العصبية ، مما سمح لنا بتصوير المزيد من الخلايا العصبية في أعماق الدماغ بسرعة أكبر ، مما عزز بشكل كبير أبحاث علم الأعصاب ومكننا من اكتساب فهم أوضح من وظائف المخ.
