التصنيف المجهري ومبدأ العمل لأبحاث الخلايا
المجهر هو الأداة الأساسية لرصد الخلايا. وفقًا لمصادر الضوء المختلفة ، يمكن تقسيمها إلى فئتين: المجاهر الضوئية والمجاهر الإلكترونية. يستخدم الأول الضوء المرئي (تستخدم مجاهر الأشعة فوق البنفسجية الضوء فوق البنفسجي) كمصدر للضوء ، بينما يستخدم الأخير أشعة الإلكترون كمصدر للضوء.
-،مايكروسكوب بصري
(1) مجهر بصري عادي
تتكون المجاهر البيولوجية العادية من ثلاثة أجزاء ، وهي: ① نظام الإضاءة ، بما في ذلك مصدر الضوء والمكثف. ② نظام تكبير بصري مكون من عدسة موضوعية وعينية وهي الجسم الرئيسي للميكروسكوب. من أجل القضاء على الانحراف الكروي والانحراف اللوني ، تستخدم كل من العدسة والجهاز الميكانيكي الموضوعي لإصلاح المادة وتسهيل المراقبة (الشكل 2-1).
لا يتم تحديد ما إذا كانت صورة المجهر واضحة من خلال التكبير فحسب ، بل تتعلق أيضًا بدقة المجهر. تشير الدقة إلى قدرة المجهر (أو أن تكون العين البشرية على بعد 25 سم من الهدف) لتمييز أصغر مسافة بين الأشياء. يتم تحديد حجم الدقة من خلال نسبة الطول الموجي وفتحة الضوء ويتم التعبير عن معامل الانكسار للوسط بالصيغة:
في الصيغة: n=معامل الانكسار للوسط؛=زاوية فتحة العدسة (زاوية فتح العينة إلى فتحة العدسة الشيئية) ، NA=فتحة العدسة (الفتحة الرقمية). تكون زاوية العدسة دائمًا أقل من 180 درجة ، لذا يجب أن تكون القيمة القصوى لـ sina / 2 أقل من 1.
معامل الانكسار للزجاج المستخدم في صنع العدسة البصرية هو 1.65 إلى 1.78 ، ومعامل الانكسار للوسيط المستخدم أقرب إلى الزجاج ، كان ذلك أفضل. بالنسبة للعدسات الموضوعية الجافة ، يكون الوسط هو الهواء ، وتكون نسبة فتحة العدسة بشكل عام 0. 0 5 إلى 0.95 ؛ بالنسبة للعدسات الزيتية ، يستخدم زيت الأرز كوسيط ، ويمكن أن تكون نسبة فتحة العدسة قريبة من 1.5.
الطول الموجي للضوء العادي هو {{0} نانومتر ، لذا فإن قيمة دقة المجهر لن تقل عن 0. 2 ميكرومتر ، ودقة عين الإنسان 0.2 مم ، لذا عادةً ما يكون الحد الأقصى لتكبير تصميم المجهر العام 1000X.
(2) الفحص المجهري الإسفار
يمكن لبعض المواد في الخلايا ، مثل الكلوروفيل ، أن تتألق بعد تعريضها للإشعاع بالأشعة فوق البنفسجية ؛ بعض المواد نفسها لا يمكن أن تتألق ، ولكن إذا كانت ملطخة بأصباغ فلورية أو أجسام مضادة فلورية ، فيمكنها أيضًا أن تتوهج عند تعريضها للأشعة فوق البنفسجية ، ويُعد مجهر التألق (الشكل 2-2 ، 3 ، 4) أحد الأدوات للبحث النوعي والكمي عن هذه المواد.
المجاهر الفلورية والمجاهر العادية لها الاختلافات التالية:
1. عادةً ما تكون طريقة الإضاءة عبارة عن إضاءة epi ، أي يتم عرض مصدر الضوء على العينة من خلال العدسة الشيئية (الشكل 2-3) ؛
2. مصدر الضوء هو الأشعة فوق البنفسجية ، وطول الموجة أقصر ، ودقة الوضوح أعلى من المجاهر العادية.
3. هناك نوعان من الفلاتر الخاصة ، المرشح الموجود أمام مصدر الضوء يستخدم لتصفية الضوء المرئي ، والواحد بين العدسة والعدسة الموضوعية يستخدم لتصفية الضوء فوق البنفسجي لحماية العينين.
(3) مجهر متحد البؤر المسح بالليزر
مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ، الشكل {0}} ، 6) يستخدم الليزر كمصدر ضوئي لمسح ضوئي ، ويقوم بمسح التصوير نقطة بنقطة ، وخطًا بخط ، وسطحًا بالسطح ، وتشارك مجموعة الليزر والفلورة المسح الضوئي في العدسة الموضوعية ، وتركيز العدسة الشيئية هو النقطة المحورية في ليزر المسح هو أيضًا نقطة الهدف للتصوير اللحظي. نظرًا لأن الطول الموجي لشعاع الليزر قصير والشعاع رقيق جدًا ، فإن مجهر المسح بالليزر المتحد البؤر يتمتع بدقة أعلى ، وهي حوالي 3 أضعاف دقة المجهر الضوئي العادي. يركز النظام مرة واحدة ويقتصر الفحص على مستوى واحد من العينة. عندما يكون عمق التركيز مختلفًا ، يمكن الحصول على صور لمستويات عمق مختلفة للعينة. يتم تخزين معلومات الصور هذه في الكمبيوتر. من خلال تحليل الكمبيوتر والمحاكاة ، يمكن عرض الهيكل ثلاثي الأبعاد لعينة الخلية.
يمكن استخدام الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر ليس فقط لمراقبة مورفولوجيا الخلية ، ولكن أيضًا للتحليل الكمي للمكونات الكيميائية الحيوية داخل الخلايا ، وإحصاءات الكثافة البصرية وقياس مورفولوجيا الخلية.
(4) مجهر المجال المظلم
يحتوي مجهر المجال المظلم (مجهر المجال المظلم ، الشكل {0}}) على ورقة ضوئية في وسط المكثف ، بحيث لا يدخل ضوء الإضاءة مباشرة إلى العدسة البشرية ، وينعكس الضوء فقط وينحرف بواسطة العينة يُسمح بدخول العدسة الشيئية ، وبالتالي فإن خلفية مجال الرؤية سوداء ، وحواف الكائنات ساطعة. باستخدام هذا المجهر ، يمكن رؤية جسيمات صغيرة مثل 4-200 نانومتر ، ويمكن أن تكون الدقة أعلى بمقدار 50 مرة من دقة المجاهر العادية.
(5) مجهر تباين الطور
تم اختراع ميكروسكوب Phasecontrast (مجهر التباين الطوري ، الشكل {0}} ، 9) بواسطة P. Zernike في عام 1932 وفاز بجائزة نوبل في الفيزياء عام 1953 عن ذلك. أكبر ميزة لهذا المجهر هي أنه يمكنه مراقبة العينات غير الملوثة والخلايا الحية.
يتمثل المبدأ الأساسي للفحص المجهري لتباين الطور في تغيير اختلاف المسار البصري للضوء المرئي الذي يمر عبر العينة إلى اختلاف في السعة ، وبالتالي تحسين التباين بين الهياكل المختلفة وجعل الهياكل المختلفة مرئية بوضوح. بعد المرور عبر العينة ، ينكسر الضوء ، وينحرف عن المسار البصري الأصلي ، ويتأخر بمقدار 1/4 درجة (الطول الموجي). تقوية ، زيادة أو تقليل السعة ، زيادة التباين. من حيث الهيكل ، تتميز مجاهر تباين الطور بميزتين خاصتين تختلفان عن المجاهر الضوئية العادية:
1. يقع الحجاب الحاجز الحلقي بين مصدر الضوء والمكثف ، وتتمثل وظيفته في جعل الضوء المار عبر المكثف يشكل مخروطًا ضوئيًا مجوفًا والتركيز على العينة.
2. تضيف لوحة الطور (لوحة الطور الحلقي) لوحة طور مطلية بفلوريد المغنيسيوم في العدسة الشيئية ، والتي يمكن أن تؤخر طور الضوء المباشر أو الضوء المنكسر بمقدار 1/4 درجة. هناك نوعان:
لوح طور زائد: تأخر الضوء المباشر بمقدار 1/4 درجة. بعد الجمع بين مجموعتي موجات الضوء ، تضاف موجات الضوء معًا ، ويزداد السعة. تكون بنية العينة أكثر إشراقًا من الوسط المحيط بها ، وتشكل تباينًا ساطعًا (أو تباينًا سلبيًا).
② B زائد لوحة الطور: تأخر الضوء المنعرج بمقدار 1/4 درجة. بعد الجمع بين مجموعتي الأشعة ، يتم طرح موجات الضوء ، وتصبح السعة أصغر ، وتشكل تباينًا داكنًا (أو تباينًا إيجابيًا) ، وتكون البنية أغمق من الوسط المحيط.
(6) مجهر مستقطب
يستخدم مجهر الاستقطاب للكشف عن المواد ذات الانكسار ، مثل الخيوط والمغازل والكولاجين والكروموسومات وما إلى ذلك. الفرق عن المجاهر العادية هو أن هناك مستقطب (مستقطب) أمام مصدر الضوء ، بحيث يكون الضوء الداخل إلى المجهر ضوءًا مستقطبًا ، وهناك محلل (مستقطب يكون اتجاه استقطابه متعامدًا مع المستقطب) في برميل العدسة. يمكن تدوير مرحلة هذا المجهر. عندما يتم وضع مادة أحادية الانكسار على المسرح ، بغض النظر عن كيفية تدوير المرحلة ، نظرًا لأن المستقطبين عموديين ، فلا يمكن رؤية أي ضوء في المجهر ، والضوء غير مرئي في المجهر. عند دخول المواد ثنائية الانكسار ، يمكن لمرحلة الدوران اكتشاف مثل هذه الأشياء لأن الضوء ينحرف أثناء مروره عبر هذه المواد.
