كيف يتم ملاحظة مورفولوجية الخلايا الميكروبية تحت المجهر؟
تم اختراع المجاهر لرؤية الأشياء المبتسمة التي لا يمكن رؤيتها بالعين المجردة. الكائنات الحية الدقيقة صغيرة جدًا، لذا يجب تكبيرها ومراقبتها بمساعدة المجهر. بالإضافة إلى ذلك، هناك أنواع عديدة من الكائنات الحية الدقيقة، لذلك يمكن لمعظم المجاهر الضوئية مراقبة الكائنات الحية الدقيقة. والسؤال التالي هو ما هو نوع المجهر الذي ينبغي استخدامه لمراقبة وتحليل أي نوع من الكائنات الحية الدقيقة. تشمل المجاهر الشائعة التي يمكن استخدامها لمراقبة التشكل الميكروبي المجاهر البيولوجية، مجاهر تباين الطور، المجاهر المقلوبة، المجاهر الفلورة، المجاهر البؤرية، إلخ.
فيما يلي وصف للمجاهر المختلفة المستخدمة لمراقبة الكائنات الحية الدقيقة:
1. يستخدم المجهر الضوئي العادي الضوء الطبيعي أو الضوء كمصدر للضوء، ويبلغ طول موجته حوالي 0.4 ميكرومتر. دقة المجهر هي نصف الطول الموجي، أي 0.2 ميكرومتر، وأصغر صورة مرئية للعين المجردة هي 0.2 ملم. ولذلك، فإن استخدام مرآة زيتية (غمر) للتكبير بمقدار 1000 مرة يمكن أن يؤدي إلى تكبير الجسيمات بحجم 0.2 ميكرومتر إلى 0.2 ملم مرئية للعين المجردة. يمكن استخدام المجاهر الضوئية العادية لمراقبة البكتيريا والفطريات الشعاعية والفطريات.
2. يُستخدم الفحص المجهري Darkfield بشكل شائع لمراقبة التشكل والحركة الميكروبية غير الملوثة. بعد تثبيت مكثف المجال المظلم في المجهر العادي، لا يمكن للضوء أن يخترق مباشرة من المنتصف، ويصبح مجال الرؤية مظلمًا. عندما تتلقى العينة ضوءًا مائلًا من حافة المكثف، يمكن أن يتشتت، لذلك يمكن ملاحظة الكائنات الحية الدقيقة الساطعة مثل البكتيريا أو اللولبيات في خلفية الحقل المظلم.
3. مجهر تباين الطور يستخدم مجهر تباين الطور التأثير الضوئي للوحة فرق الطور لتغيير طور الضوء وسعة الضوء المباشر، وتحويل فرق طور الضوء إلى فرق شدة الضوء. تحت مجهر تباين الطور، عندما يمر الضوء عبر عينة غير ملوثة، يحدث الاختلاف في طور الضوء بسبب عدم تناسق كثافة الأجزاء المختلفة من العينة، ويمكن ملاحظة التشكل والبنية الداخلية وطريقة الحركة للكائنات الحية الدقيقة.
4. المجهر الفلوري المجهر الفلوري هو في الأساس نفس المجهر الضوئي العادي، والفرق الرئيسي هو مصدر الضوء والمرشح والمكثف. في الوقت الحاضر، يستخدم معظمهم أجهزة epi-light، وتستخدم مصابيح الزئبق عالية الضغط بشكل شائع كمصادر للضوء، والتي يمكن أن تنبعث منها الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق البنفسجي. هناك نوعان من المرشحات: مرشح الإثارة ومرشح الامتصاص. بالإضافة إلى مكثفات المجال الساطع العامة، يمكن أيضًا استخدام مكثفات المجال المظلم في المجاهر الفلورية باستخدام الضوء الأزرق لتعزيز التباين بين التألق والخلفية. تنطبق هذه الطريقة على اكتشاف أو تحديد البكتيريا الملطخة بأصباغ الفلورسنت أو المدمجة مع الأجسام المضادة الفلورية.
5. تستخدم المجاهر الإلكترونية تدفق الإلكترون كمصدر للضوء، ويختلف الطول الموجي عشرات الآلاف من المرات عن الضوء المرئي، مما يحسن الدقة بشكل كبير. كما أنه يستخدم ملفًا مغناطيسيًا كنظام تضخيم بصري، ويمكن أن يصل التكبير إلى عشرات الآلاف أو مئات الآلاف من المرات. وغالبًا ما يستخدم لمراقبة جزيئات الفيروس والبنية التحتية البكتيرية.
مراقبة العينات الميكروبية غير الملوثة:
يمكن عمومًا استخدام العينات غير الملوثة لمراقبة مورفولوجيا البكتيريا وقوتها وحركتها. البكتيريا عديمة اللون وشفافة عندما تكون غير ملوثة، ويمكن ملاحظتها تحت المجهر بشكل رئيسي عن طريق الفرق بين معامل انكسار البكتيريا والبيئة المحيطة. تتحرك البكتيريا ذات الأسواط بقوة، بينما تظهر البكتيريا التي لا تحتوي على أسواط حركة براونية غير منتظمة. البكتيريا القابلة للحياة مثل اللولبية الشاحبة، والليبتوسبيرا، والعطيفة لها أشكال وأنماط حركة مميزة، والتي لها أهمية تشخيصية. الطرق المستخدمة بشكل شائع هي طريقة انخفاض الضغط، وطريقة إسقاط القلادة، وطريقة الشعرية.
1. ضع الفازلين حول الفتحة المقعرة للزجاج المقعر النظيف بطريقة القطرة المعلقة، واستخدم حلقة التلقيح لأخذ حلقة من المعلق البكتيري ووضعها في وسط الغطاء الزجاجي، ثم قم بمحاذاة الفتحة المقعرة للزجاج المقعر مع القطرة في وسط زجاج الغطاء وقم بتغطيته، ثم اقلبه بسرعة، واضغط على زجاج الغطاء بخفة لجعله يلتصق بإحكام بالفازلين الموجود على حافة الثقب المقعر، ولاحظه تحت مجهر عالي التكبير (أو حقل مظلم).
2. خذ حلقة من المعلق البكتيري مع حلقة التطعيم وضعها في وسط شريحة زجاجية نظيفة بطريقة هبوط الضغط، وقم بتغطية المعلق البكتيري بلطف بغطاء زجاجي، مع الحرص على تجنب الفقاعات وفيضان المعلق البكتيري . بعد الوقوف ساكنًا لبضع ثوان، راقب تحت مجهر عالي الطاقة في مجال مشرق (أو مجال مظلم).
3. تستخدم الطريقة الشعرية بشكل أساسي لفحص حركية البكتيريا اللاهوائية. عادةً ما تختار طولًا يبلغ 60~70ملم. بعد سحب تعليق البكتيريا اللاهوائية من خلال أنبوب شعري بفتحة قدرها 0.5-1.0 مم، أغلق طرفي الأنبوب الشعري باللهب. تم تثبيت الشعيرات الدموية على الشريحة الزجاجية بورق بلاستيكي، وتم ملاحظتها تحت عدسة عالية الطاقة في المجال المظلم.
مراقبة العينات الميكروبية الملونة بالمجهر:
بعد تلطيخ العينة البكتيرية، بسبب التباين الحاد في اللون بين البكتيريا والبيئة المحيطة، تظهر الخصائص المورفولوجية للبكتيريا (مثل الحجم والشكل والترتيب وما إلى ذلك) للبكتيريا وبعض الهياكل الخاصة (مثل (مثل الكبسولات، والسوط، والجراثيم، وما إلى ذلك) يمكن ملاحظتها بوضوح تحت المجهر الضوئي العادي، ويمكن تصنيف البكتيريا وتحديدها وفقًا لتفاعل الصبغ.
(1) الإجراء العام للتلوين البكتيري الإجراء العام للتلوين البكتيري هو: اللطاخة (التجفيف) - التثبيت - التلطيخ.
1. تحضير اللطاخة للدم، والإفرازات، والإفرازات، وثقب السوائل والمستنبتات السائلة، وتوجيه مسحات الأغشية الرقيقة على شرائح زجاجية؛ تشريح الجثة أو أنسجة الحيوانات المصابة، ومسح الآفة باستخدام قطعة من القطن لأخذ العينات. لتحضير المستعمرات البكتيرية أو المروج على وسط صلب، استخدم أولاً حلقة تلقيح لأخذ حلقة من المحلول الملحي العادي ووضعها في وسط الشريحة الزجاجية، ثم استخدم حلقة تلقيح معقمة لأخذ كمية صغيرة من المزرعة وطحنها بالتساوي في محلول ملحي عادي، قم بتوزيعه على سطح مطلي بمساحة 1 سم 2، واتركه يجف بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة أو يجف ببطء على مسافة.
2. الغرض من التثبيت هو قتل البكتيريا، وتخثير البروتين البكتيري وبنيته، وتسهيل تلطيخه؛ تشجيع البكتيريا على الالتصاق بالشريحة لتجنب غسلها بالماء أثناء الغسيل؛ تغيير نفاذية البكتيريا إلى الأصباغ، وهو أمر مفيد لتلطيخ الهياكل البكتيرية داخل الخلايا. عادة ما يتم تثبيته عن طريق التسخين باللهب، ويتم تمرير اللطاخة المجففة بسرعة عبر اللهب لمدة 3 مرات. من الأفضل عدم حرق الجلد الموجود على ظهر اليد عند ملامسته للشريحة.
3. الصباغة وفقا لأغراض التفتيش المختلفة، اختر طرق الصباغة المختلفة للصباغة. عند الصباغة، أضف محلول الصبغة قطرة قطرة لزيادة التغطية.
4. مادة لاذعة أي مادة يمكنها تعزيز التقارب بين الصبغة والجسم المصبوغ، وتثبيت الصبغة على الجسم المصبوغ وتسبب تغيير في نفاذية غشاء الخلية تسمى مادة لاذعة. يشيع استخدام الشب وحمض التانيك والأملاح المعدنية واليود وما إلى ذلك، ويستخدم التسخين أيضًا لتعزيز التلوين. يمكن استخدام Mordants بين التلوين الأولي والتلطيخ المضاد، ويمكن استخدامه أيضًا بعد التثبيت أو تضمينه في المثبت والتلطيخ.
5. إزالة اللون أي عامل كيميائي يمكنه إزالة لون الجسم المصبوغ يسمى مزيل اللون. يشيع استخدام الإيثانول والأسيتون وما إلى ذلك كمزيلات للألوان. يمكن لعامل إزالة اللون اكتشاف درجة ثبات مزيج البكتيريا والأصباغ، والتي يمكن استخدامها للتلوين التفاضلي.
6. مكافحة البقع البكتيريا أو هياكلها التي تم إزالة لونها غالبًا ما تتم مقاومة البقع بمحلول مضاد للبقع لسهولة المراقبة. يختلف لون محلول الصبغ المضاد عن لون محلول الصباغة الأساسي لتكوين تباين حاد. لا ينبغي أن يكون الصبغ المضاد قويًا جدًا، حتى لا يغطي لون الصبغة الأولية.
