الفرق بين المجهر الفلوري والمجهر العادي
1. انظر إلى طريقة الإضاءة
طريقة إضاءة المجهر الفلوري بشكل عام هي نوع epi ، أي أن مصدر الضوء يوضع على عينة الاختبار من خلال العدسة الموضوعية.
2. انظر إلى القرار
تستخدم مجاهر الإسفار الضوء فوق البنفسجي كمصدر للضوء ، بطول موجي قصير نسبيًا ، لكن الدقة أعلى من تلك الخاصة بالمجاهر الضوئية العادية.
3 ، الفرق في التصفية
يستخدم مجهر الإسفار مرشحين خاصين ، يستخدمان أمام مصدر الضوء لتصفية الضوء المرئي ، ويستخدمان بين العدسة الموضوعية والعينية لتصفية الضوء فوق البنفسجي ، والذي يمكن أن يحمي العين البشرية.
مجهر الإسفار هو أيضًا نوع من المجهر الضوئي ، ويرجع ذلك أساسًا إلى قصر الطول الموجي الذي يثيره المجهر الفلوري ، لذلك يؤدي هذا إلى اختلاف في بنية واستخدام المجهر الفلوري والمجهر العادي. معظم المجاهر الفلورية لها وظيفة جيدة في التقاط الضوء الضعيف. ، لذلك في ظل التألق الضعيف للغاية ، تكون قدرته على التصوير جيدة أيضًا. إلى جانب التحسين المستمر للفحص المجهري الفلوري في السنوات الأخيرة ، تم أيضًا تقليل الضوضاء بشكل كبير. لذلك ، يتم استخدام المزيد والمزيد من المجاهر الفلورية.
معرفة الفحص المجهري ثنائي الفوتون
المبدأ الأساسي للإثارة ثنائية الفوتون هو: في حالة كثافة الفوتون العالية ، يمكن للجزيئات الفلورية أن تمتص فوتونين بطول موجي طويل في نفس الوقت ، وبعد فترة قصيرة جدًا تسمى حالة الإثارة ، تصدر فوتونًا بطول موجي قصير ؛ التأثير مماثل لاستخدام فوتون بطول موجي نصف طول موجي طويل لإثارة جزيء الفلورسنت. تتطلب الإثارة ثنائية الفوتون كثافة عالية من الفوتون ، ومن أجل عدم إتلاف الخلايا ، يستخدم الفحص المجهري للفوتونين ليزرات نبضية ذات طاقة عالية مقفلة. يصدر هذا الليزر ضوء الليزر مع طاقة ذروة عالية ومتوسط طاقة منخفض ، بعرض نبضة لا يتجاوز 100 فمتوثانية وتردد من 80 إلى 100 ميجاهرتز. عند استخدام عدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية لتركيز فوتونات الليزر النبضي ، تكون كثافة الفوتون عند النقطة المحورية للعدسة الموضوعية هي الأعلى ، ويحدث الإثارة ثنائية الفوتون فقط عند النقطة المحورية للعدسة الشيئية ، لذلك لا يحتاج المجهر ثنائي الفوتون إلى ثقب متحد البؤر ، مما يحسن كفاءة الكشف عن الإسفار.
في ظاهرة التألق العامة ، نظرًا لانخفاض كثافة الفوتون لضوء الإثارة ، يمكن للجزيء الفلوري أن يمتص فوتونًا واحدًا فقط في نفس الوقت ، ثم يصدر فوتونًا مضيئًا من خلال انتقال الإشعاع ، وهو ما يسمى مضان الفوتون الفردي. بالنسبة لعملية الإثارة الفلورية باستخدام الليزر كمصدر للضوء ، قد تحدث ظاهرة مضان ثنائي الفوتون أو حتى متعدد الفوتونات. في هذا الوقت ، تكون شدة مصدر ضوء الإثارة المستخدم عالية ، وتفي كثافة الفوتون بمتطلبات أن يمتص جزيء الفلورسنت فوتونين في نفس الوقت. في عملية استخدام الليزر العام كمصدر للضوء المثير ، لا تزال كثافة الفوتون غير كافية لإنتاج امتصاص ثنائي الفوتون. عادة ، يتم استخدام ليزر نبضي فيمتوثانية ، ويمكن أن تصل قوته اللحظية إلى حد ميغاواط. لذلك ، فإن الطول الموجي للفلورة ثنائية الفوتون هو أقصر من الطول الموجي لضوء الإثارة ، وهو ما يعادل التأثير الناتج عن الإثارة نصف الطول الموجي للإثارة.
يتميز الفحص المجهري ثنائي الفوتون بالعديد من المزايا:
1) الضوء ذو الطول الموجي الطويل أقل تأثراً بالانتثار من الضوء قصير الموجة ويمكن أن يخترق العينة بسهولة ؛
2) جزيئات الفلورسنت خارج المستوى البؤري ليست متحمسة ، بحيث يمكن أن يصل المزيد من ضوء الإثارة إلى المستوى البؤري ، بحيث يمكن لضوء الإثارة اختراق عينات أعمق ؛
3) الضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء ذو الطول الموجي الطويل أقل سمية للخلايا من الضوء قصير الموجة ؛
4) عند عرض العينات باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون ، يكون التبييض الضوئي والسمية الضوئية موجودين فقط في المستوى البؤري. لذلك ، يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون أكثر ملاءمة لعرض العينات السميكة من الفحص المجهري للفوتون الفردي ، أو لعرض الخلايا الحية ، أو لإجراء تجارب التبييض الضوئي ذات النقطة الثابتة.
المعرفة بالمجهر متحد البؤر مضان
المبدأ الأساسي للفحص المجهري متحد البؤر: باستخدام مصدر ضوء نقطي لإلقاء الضوء على العينة ، يتم تشكيل بقعة ضوئية صغيرة ذات مخطط واضح على المستوى البؤري. تتكون من شعاع الخائن. يرسل مقسم الحزمة الفلورة مباشرة إلى الكاشف. يوجد ثقب أمام مصدر الضوء والكاشف ، يسمى على التوالي ثقب الإضاءة وثقب الكشف. الأبعاد الهندسية للاثنين هي نفسها ، حوالي 100-200 نانومتر ؛ بالنسبة إلى بقعة الضوء على المستوى البؤري ، فإن الاثنين مترافقان ، أي أن بقعة الضوء تمر عبر سلسلة من العدسات ، وأخيراً يمكن التركيز على ثقب الإضاءة وثقب الكشف في نفس الوقت. بهذه الطريقة ، يمكن تركيز الضوء من المستوى البؤري ضمن نطاق فتحة الكشف ، بينما يتم حظر الضوء المتناثر من أعلى أو أسفل المستوى البؤري من فتحة الكشف ولا يمكن تصويره. يتم مسح العينة نقطة تلو الأخرى باستخدام الليزر ، ويحصل الأنبوب المضاعف الضوئي بعد اكتشاف الثقب أيضًا على الصورة البؤرية لنقطة الضوء المقابلة بنقطة بنقطة ، والتي يتم تحويلها إلى إشارة رقمية ونقلها إلى الكمبيوتر ، وفي النهاية يتم تجميعها على الشاشة في صورة (كنفوكل) واضحة للطائرة البؤرية بأكملها. .
كل صورة مستوى بؤري هي في الواقع مقطع عرضي بصري للعينة ، وهذا المقطع العرضي البصري دائمًا ما يكون له سمك معين ، يُعرف أيضًا بالشريحة الضوئية. نظرًا لأن شدة الضوء عند النقطة البؤرية أكبر بكثير من تلك الموجودة في النقطة غير البؤرية ، ويتم ترشيح ضوء المستوى غير البؤري بواسطة الثقب ، فإن عمق مجال النظام البؤري يكون صفرًا تقريبًا ، والمسح على طول يمكن للمحور Z أن يحقق التصوير المقطعي البصري ، مكونًا قسم مراقبة ثنائي الأبعاد في البقعة المركزة للعينة. الجمع بين مسح المستوى XY (المستوى البؤري) مع مسح المحور Z (المحور البصري) ، من خلال تجميع صور ثنائية الأبعاد للطبقات المتتالية ومعالجتها بواسطة برنامج كمبيوتر خاص ، يمكن الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد للعينة.
أي أن ثقب الكشف وثقب مصدر الضوء دائمًا ما يركزان على نفس النقطة ، بحيث لا يمكن للفلور المتحمس خارج مستوى التركيز الدخول إلى ثقب الكشف.
التعبير البسيط لمبدأ عمل الليزر متحد البؤر هو أنه يستخدم الليزر كمصدر للضوء ، وعلى أساس التصوير بالمجهر الفلوري التقليدي ، يتم إرفاق جهاز المسح بالليزر وجهاز التركيز المتقارن ، والحصول على الصور الرقمية ومعالجتها يتم التحكم في النظام بواسطة جهاز كمبيوتر.
