مقارنة بين التقنيات المختلفة للفحص المجهري فائق الدقة
بالنسبة للفحص المجهري للضوء التقليدي ، يحد انحراف الضوء من دقة التصوير إلى حوالي 250 نانومتر. اليوم ، يمكن لتقنيات الدقة الفائقة تحسين هذا بأكثر من 10 عامل. يتم تحقيق هذه التقنية بشكل أساسي من خلال ثلاث طرق: الفحص المجهري لتحديد موقع الجزيء الفردي ، بما في ذلك الفحص المجهري لتحديد المواقع الحساسة للضوء (PALM) والفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ؛ مجهر الإضاءة المنظم (SIM) ؛ والتحفيز المجهري لاستنفاد الانبعاث (STED). إن كيفية اختيار تقنية الدقة الفائقة هو ما يهتم به الجميع. يقول ماثيو ستراسي ، باحث ما بعد الدكتوراه في جامعة أكسفورد بالمملكة المتحدة: "لسوء الحظ ، لا توجد مبادئ بسيطة لتحديد الطريقة التي يجب استخدامها". "لكل منها مزاياه وعيوبه." يتعرف العلماء بالطبع أيضًا على كيفية اختيار الطريقة الصحيحة لمشروع معين. "في سياق التصوير الحيوي ، تشمل العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها: الدقة المكانية والزمانية ، والحساسية للتلف الضوئي ، وسعة الوسم ، وسماكة العينة ، وإضاءة الخلفية أو الإسفار الذاتي للخلية." كيف تعمل تعمل المجاهر المختلفة فائقة الدقة بطرق مختلفة. في حالة PALM و STORM ، يتم تحمس أو تنشيط ضوئي لجزء صغير فقط من علامات الفلورسنت في لحظة معينة ، مما يتيح توطينها المستقل بدقة عالية. يؤدي إجراء هذه العملية مع جميع ملصقات الفلورسنت إلى الحصول على صورة كاملة فائقة الدقة. قال ستيفان هيل ، أحد الفائزين بجائزة نوبل في الكيمياء لعام 2014 ومدير معهد ماكس بلانك للكيمياء الفيزيائية الحيوية: "نظام PALM / STORM سهل الإعداد نسبيًا ، لكن من الصعب تطبيقه ، لأن الفلورسنت يجب أن تتمتع المجموعة بقدرة التنشيط الضوئي. العيوب هي أنها تحتاج إلى اكتشاف جزيء فلوري واحد في سياق الخلية ، وهي أقل موثوقية من STED. " يستخدم STED نبضة ليزر لإثارة الفلوروفور والليزر على شكل حلقة لإخماد الفلوروفور ، تاركًا فقط مضانًا متوسط الحجم بحجم النانومتر للحصول على دقة فائقة. مسح العينة بأكملها ينتج صورة. وأوضح هيل: "ميزة STED هي أنها تقنية الضغط على الزر". "إنه يعمل مثل مجهر متحد البؤر مضان." يمكنه أيضًا تصوير الخلايا الحية باستخدام الفلوروفورات مثل البروتينات الفلورية الخضراء أو الصفراء والأصباغ المشتقة من رودامين. المقارنة البارامترية على الرغم من أن جميع تقنيات الدقة الفائقة تتجاوز مجهر الضوء التقليدي من حيث الدقة ، إلا أنها تختلف عن بعضها البعض. تضاعف SIM تقريبًا الدقة إلى حوالي 100 نانومتر. يمكن لـ PALM و STORM حل أهداف 15 نانومتر. وفقًا لـ Hell ، يوفر STED دقة مكانية تبلغ 30 نانومتر في الخلايا الحية و 15 نانومتر في الخلايا الثابتة. عندما يتعلق الأمر بتطبيقات محددة ، يجب علينا أيضًا مراعاة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. في بعض الحالات ، قد تؤدي الدقة المنخفضة ولكن نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) الأعلى إلى الحصول على صورة أفضل من العكس (دقة أعلى ولكن نسبة SNR أقل). تعد سرعة الحصول على الصور مهمة جدًا أيضًا ، خاصة بالنسبة للخلايا الحية. قال ستراسي: "جميع تقنيات الدقة الفائقة أبطأ من تقنيات التصوير الفلوري التقليدية". "PALM / STORM هي الأبطأ ، فهي تحتاج إلى عشرات الآلاف من الإطارات للحصول على صورة واحدة ، وتحتاج بطاقة SIM لعشرات الإطارات ، و STED هي تقنية مسح ضوئي ، لذا فإن سرعة الاستحواذ تعتمد على حجم مجال الرؤية." بالإضافة إلى الخلايا الحية أو خلايا التصوير الثابتة ، يريد بعض العلماء أيضًا فهم كيفية تحرك الأشياء. يهتم ستراسي بفهم ديناميكيات الأنظمة البيولوجية في الخلايا الحية ، وليس فقط الصور الثابتة. فهو يجمع بين PALM وتتبع الجسيمات الفردية لتحليل الديناميكيات في الخلايا الحية. وبهذه الطريقة ، يمكنه تتبع جزيئات العلامة بشكل مباشر أثناء قيامها بوظائفها. ومع ذلك ، فهو يعتقد أن SIM ليست مناسبة لدراسة هذه العمليات الديناميكية على المستوى الجزيئي ، ولكن نظرًا لسرعة اكتسابها السريعة ، فهي مناسبة بشكل خاص لمراقبة ديناميكيات الهياكل الأكبر ، مثل الكروموسومات بأكملها. أحدث النتائج في عام 2017 ، أبلغ فريق Hell عن مجهر MINFLUX فائق الدقة في العلوم. وفقًا لـ Hell ، تحقق طريقة الدقة الفائقة هذه دقة مكانية تبلغ 1 نانومتر لأول مرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنه تتبع الجزيئات الفردية في الخلايا الحية بمعدل 100 مرة على الأقل أسرع من الطرق الأخرى. أشاد علماء آخرون أيضًا بمجهر MINFLUX. قال شيختمان: "يتم تطوير تطبيقات ومقاربات جديدة باستمرار ، ولكن برز تقدمان لي". واحد هو MINFLUX. "إنها تستخدم نهجًا بارعًا للحصول على تحديد دقيق للغاية للجزيئات." فيما يتعلق بالتطور الثاني المثير ، ذكر شيختمان WE Moerner وزملائه في جامعة ستانفورد. حصل Moerner أيضًا على جائزة نوبل في الكيمياء لعام 2014. أحد الفائزين. لمعالجة محدودية دقة التصوير الناتجة عن التشتت متباين الخواص للجزيئات المفردة الفلورية ، استخدم العلماء استقطابات الإثارة المختلفة لتحديد اتجاه الجزيئات وموضعها. بالإضافة إلى ذلك ، فقد طوروا أسطحًا دقيقة للحدقة. تعمل هذه التقنيات على تحسين القدرة على توطين الهياكل. حول ملصقات الفلورسنت في العديد من التطبيقات فائقة الدقة ، تعتبر الملصقات مهمة حقًا. هناك أيضًا بعض الشركات التي تقدم منتجات ذات صلة. على سبيل المثال ، تعاونت شركة Miltenyi الألمانية مع Abberior ، وهي شركة أسسها Stefan Hell ، لتوفير خدمات اقتران الأجسام المضادة المخصصة للأصباغ المجهرية فائقة الدقة. يقدم عدد من الشركات الأخرى أيضًا علامات مطابقة. يقول كريستوف إيكرت ، مسؤول التسويق في ChromoTek: "إن معززات النانو لدينا صغيرة جدًا ، فقط 1.5 كيلو دالتون ، ومحددة للغاية". تربط هذه البروتينات البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء (GFP و RFP). وهي مشتقة من شظايا الأجسام المضادة للألبكة ، والمعروفة باسم VHH أو الأجسام النانوية ، مع خصائص ربط ممتازة وجودة مستقرة دون تغيير دفعة إلى دفعة. هذه العلامات مناسبة لمختلف تقنيات الدقة الفائقة بما في ذلك SIM و PALM و STORM و STED. استخدم Ai-Hui Tang ، الأستاذ المساعد في كلية الطب بجامعة ميريلاند ، وزملاؤه ChromoTek's GFP-Booster و STORM لاستكشاف انتشار المعلومات في الجهاز العصبي. وجدوا العناقيد النانوية الجزيئية ، تسمى nanocolumns ، في الخلايا العصبية قبل المشبكي وما بعد المشبكي. يعتقد العلماء أن هذه البنية تظهر أن الجهاز العصبي المركزي يستخدم مبادئ بسيطة للحفاظ على الكفاءة التشابكية وتنظيمها. تعمل الإصدارات المختلفة من التصوير فائق الدقة وعدد متزايد من الأساليب على نقل العلماء إلى عمق أكبر في الألغاز البيولوجية. من خلال كسر حد الانعراج للضوء المرئي ، يمكن لعلماء الأحياء "مراقبة" أفعال الخلايا عن كثب.
