يتميز المجهر الفلوري ثنائي الفوتون بالعديد من المزايا:

يتميز المجهر الفلوري ثنائي الفوتون بالعديد من المزايا:

1) الأطوال الموجية الأطول للضوء أقل تأثراً بالتشتت من الأطوال الموجية الأقصر للضوء التي تخترق العينة؛

(2) لا يتم تحفيز جزيئات الفلورسنت خارج المستوى البؤري بحيث يمكن أن يصل المزيد من ضوء الإثارة إلى المستوى البؤري، بحيث يمكن لضوء الإثارة أن يخترق العينة بشكل أعمق؛

3) الأطوال الموجية الأطول للضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء أقل سمية للخلايا من الأطوال الموجية الأقصر؛

4) عند استخدام مجهر ثنائي الفوتون لمراقبة العينة، فإن التبييض الضوئي والسمية الضوئية موجودان فقط في المستوى البؤري. لذلك، تعد المجاهر ثنائية الفوتون أكثر ملاءمة من المجاهر أحادية الفوتون لمراقبة العينات السميكة، أو لمراقبة الخلايا الحية، أو لإجراء تجارب التبييض الضوئي الموضعي.

المعرفة المجهر مضان متحد البؤر
المبدأ الأساسي للمجهر الفلوري متحد البؤر: يتم استخدام مصدر ضوء نقطي لتشعيع العينة، وتشكيل نقطة ضوء صغيرة محددة جيدًا على المستوى البؤري. يتم جمع التألق المنبعث من هذه النقطة بعد التشعيع بواسطة العدسة الموضوعية وإرساله مرة أخرى إلى جهاز تقسيم الشعاع الذي يتكون من مرآة لونية ثنائية الاتجاه على طول مسار ضوء التشعيع الأصلي. يرسل مقسم الشعاع الفلورة مباشرة إلى الكاشف. يحتوي كل من مصدر الضوء والكاشف على ثقب صغير أمامهما، يسمى ثقب الإضاءة وثقب الكشف، على التوالي. كلاهما لهما نفس الهندسة، حوالي 100-200 نانومتر، وهما مترافقان بالنسبة لنقطة الضوء على المستوى البؤري، أي أن نقطة الضوء تمر عبر سلسلة من العدسات ويمكن في النهاية تركيزها على كل من العدسات المضيئة وثقوب الكاشف. بهذه الطريقة، يمكن أن يتقارب الضوء من المستوى البؤري داخل فتحة المسبار، في حين يتم حظر الضوء المتناثر من أعلى أو أسفل المستوى البؤري خارج فتحة المسبار ولا يمكن تصويره. يقوم الليزر بمسح العينة نقطة بنقطة، ويحصل أنبوب المضاعف الضوئي بعد اكتشاف الثقب أيضًا على صورة متحد البؤر لنقطة الضوء المقابلة نقطة بنقطة، والتي يتم تحويلها إلى إشارة رقمية وإرسالها إلى الكمبيوتر، وتتقارب أخيرًا في صورة واضحة صورة متحد البؤر للمستوى البؤري بأكمله على الشاشة.

كل صورة مستوى بؤري هي في الواقع مقطع عرضي بصري للعينة، وهذا المقطع العرضي البصري دائمًا ما يكون له سُمك معين، يُعرف أيضًا باسم الورقة الضوئية. نظرًا لأن شدة الضوء عند النقطة البؤرية أكبر بكثير من تلك الموجودة عند النقطة غير البؤرية، ويتم ترشيح ضوء المستوى غير البؤري بواسطة الثقب، فإن عمق مجال النظام البؤري يقترب من الصفر، ويتم المسح على طول اتجاه المحور Z، يمكّن التصوير المقطعي البصري من تشكيل شريحة بصرية ثنائية الأبعاد للعينة يمكن ملاحظتها في النقطة البؤرية. من خلال الجمع بين مسح مستوى XY (المستوى البؤري) ومسح المحور Z (المحور البصري)، يمكن الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد للعينة من خلال تجميع طبقات متتالية من الصور ثنائية الأبعاد، والتي تتم معالجتها بواسطة برامج كمبيوتر متخصصة.

وهذا يعني أن ثقب الكشف وثقب مصدر الضوء يتم تركيزهما دائمًا في نفس النقطة، بحيث لا يمكن للفلورة المثارة خارج المستوى البؤري أن تدخل ثقب الكشف.

يتم التعبير عن مبدأ عمل متحد البؤر الليزر ببساطة بأنه يستخدم الليزر كمصدر للضوء، على أساس التصوير المجهري الفلوري التقليدي، وجهاز المسح الضوئي بالليزر الإضافي وجهاز التركيز المترافق، من خلال التحكم بالكمبيوتر لتنفيذ نظام الحصول على الصور الرقمية ومعالجتها.