طريقة المراقبة الرئيسية للمجهر الضوئي هي مراقبة الفلورة
يشير التألق إلى العملية التي تبعث فيها مادة الفلورسنت الضوء بطول موجة أطول في وقت واحد تقريبًا عندما يتم تشعيعها بضوء بطول موجة محدد (الشكل 1). عندما يصطدم ضوء بطول موجة محدد (طول موجة الإثارة) بجزيء ، مثل تلك الموجودة في الفلوروفور ، يتم امتصاص طاقة الفوتون بواسطة إلكترونات الجزيء. بعد ذلك ، تنتقل الإلكترونات من الحالة الأرضية (S 0) إلى مستوى طاقة أعلى ، الحالة المثارة (S1 '). هذه العملية تسمى الإثارة①. يبقى الإلكترون في حالة الإثارة لمدة 10-9 - 10-8 ثانية ، يفقد خلالها الإلكترون بعض الطاقة②. أثناء عملية خروج الإلكترونات من الحالة المثارة (S1) والعودة إلى الحالة الأرضية③ ، يتم تحرير الطاقة المتبقية الممتصة أثناء عملية الإثارة.
وقت بقاء الجزيء الفلوري في الحالة المثارة هو عمر التألق ، والذي يكون بشكل عام على مستوى النانو ثانية ، وهو خاصية متأصلة في جزيء الفلورسنت نفسه. يُطلق على التصوير مدى الحياة الفلوريسنت (FLIM) ، الذي يستخدم تقنية التصوير الفلوري مدى الحياة ، التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM). بالإضافة إلى تصوير كثافة التألق ، يمكن الحصول على قياسات وظيفية ودقيقة أكثر عمقًا للحصول على التشكل الجزيئي والتفاعلات بين الجزيئات والبيئة المكروية للجزيئات. المعلومات التي يصعب الحصول عليها بالتصوير البصري التقليدي.
خاصية أخرى مهمة للفلورة هي تحول ستوكس ، الفرق في الطول الموجي بين الإثارة وقمم الانبعاث (الشكل 2). عادةً ما يكون الطول الموجي للانبعاث أطول من الطول الموجي للإثارة. وذلك لأن الإلكترونات ستفقد جزءًا من طاقتها من خلال عملية الاسترخاء بعد إثارة المادة الفلورية وقبل إطلاق الفوتونات. من السهل ملاحظة المواد الفلورية ذات التحولات الأكبر في ستوكس تحت مجهر التألق.
مجهر مضان ومكعبات الفلورة الفلورية
مجهر الإسفار هو مجهر ضوئي يستخدم خصائص التألق للمراقبة والتصوير ، ويستخدم على نطاق واسع في مختلف المجالات مثل بيولوجيا الخلية ، وعلم الأعصاب ، وعلم النبات ، وعلم الأحياء الدقيقة ، وعلم الأمراض ، وعلم الوراثة. يتميز التصوير الفلوري بمزايا الحساسية العالية والنوعية العالية ، وهو مناسب جدًا لمراقبة توزيع البروتينات والعضيات المحددة في الأنسجة والخلايا ، ودراسة التنسيق والتفاعل ، وتتبع العمليات الديناميكية للحياة مثل تغيرات تركيز الأيونات ، إلخ.
معظم الجزيئات في الخلايا لا تتألق ، ولرؤيتها يجب أن تكون مُوسمة بالفلوريسنت. هناك العديد من طرق وضع العلامات الفلورية ، مثل الوسم المباشر (مثل استخدام DAPI لتسمية الحمض النووي) ، أو التلوين المناعي باستخدام خصائص ربط المستضد للأجسام المضادة ، أو استخدام البروتينات الفلورية (مثل GFP ، بروتين الفلورسنت الأخضر) لتسمية البروتينات المستهدفة ، والربط القابل للانعكاس. الأصباغ الاصطناعية (مثل Fura -2) وما إلى ذلك.
في الوقت الحاضر ، أصبح مجهر التألق معدات التصوير القياسية لمختلف المعامل ومنصات التصوير ، وهو مساعد جيد لتجاربنا اليومية. تنقسم مجاهر الإسفار بشكل أساسي إلى ثلاث فئات: مجاهر مضان منتصبة (مناسبة للتقطيع) ، مجاهر مضان مقلوبة (مناسبة للخلايا الحية ، مع مراعاة التقطيع) ، مجسات الفلورسنت (مناسبة للعينات الأكبر ، مثل النباتات ، الزرد (الكبار / الجنين) ) ، medaka ، فأر / فأر ، إلخ).
كتلة مرشح الإسفار هي المكون الأساسي للتصوير الفلوري بالمجهر. وهو يتألف من ثلاثة أجزاء: مرشح الإثارة ، ومرشح الانبعاث ، وموزع شعاع مزدوج اللون. يتم تثبيته في عجلة الترشيح. على سبيل المثال ، تم تجهيز Leica DMi8 بعجلة ترشيح موضع 6- (الشكل 3). سيكون عدد مواضع عجلات المجهر المختلفة مختلفًا ، وبعض المجاهر تستخدم شرائح كتلة المرشح.
تلعب كتلة المرشح دورًا مهمًا في التصوير الفلوري: يختار مرشح الإثارة ضوء الإثارة لإثارة العينة ، ويمنع الضوء من الأطوال الموجية الأخرى ؛ يمر الضوء الذي يمر عبر مرشح الإثارة عبر المرآة ثنائية اللون (وظيفتها هي عكس ضوء الإثارة ونقل التألق) ، وبعد الانعكاس ، يتم تركيزه بواسطة العدسة الموضوعية ، ويشع العينة ، ويثير الفلورة المقابلة ، أي الضوء المنبعث. يتم جمع الضوء المنبعث بواسطة العدسة الشيئية ، ويمر عبر فاصل الحزمة ثنائية اللون ، ويصل إلى مرشح الانبعاث. كما هو موضح في الشكل 4: الطول الموجي للإثارة هو 450-490 نانومتر ، تعكس المرآة ثنائية اللون ضوءًا أقصر من 510 نانومتر ، وتنقل الضوء الأطول من 510 نانومتر ، ونطاق استقبال الضوء المنبعث هو 520-560 نانومتر.
