طريقة المراقبة الرئيسية للمجهر الضوئي هي مراقبة الفلورة
ظاهرة الإسفار
يشير الإسفار إلى العملية التي تبعث فيها مادة الفلورسنت الضوء بطول موجة أطول في وقت واحد تقريبًا عند تشعيعها بضوء بطول موجة محدد (الشكل 1). عندما يضرب الضوء ذو الطول الموجي المحدد (الطول الموجي للإثارة) جزيء (مثل جزيء في فلوروفور) ، يتم امتصاص طاقة الفوتون بواسطة إلكترونات الجزيء. بعد ذلك ، تنتقل الإلكترونات من الحالة الأرضية (S 0) إلى مستوى طاقة أعلى ، الحالة المثارة (S1 '). هذه العملية تسمى الإثارة①. يبقى الإلكترون في حالة الإثارة لمدة 10-9 - 10-8 ثانية ، يفقد خلالها الإلكترون بعض طاقته ②. في عملية مغادرة الحالة المثارة (S1) والعودة إلى الحالة الأرضية ③ ، سيتم إطلاق الطاقة المتبقية الممتصة أثناء عملية الإثارة.
وقت بقاء الجزيء الفلوري في الحالة المثارة هو عمر التألق ، بشكل عام بالنانو ثانية ، وهي خاصية متأصلة في الجزيء الفلوري نفسه. تسمى تقنية التصوير باستخدام عمر التألق التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) ، والتي يمكنها إجراء قياسات وظيفية ودقيقة أكثر عمقًا بالإضافة إلى تصوير كثافة التألق للحصول على التشكل الجزيئي والتفاعلات بين الجزيئات والبيئات الجزيئية الدقيقة. المعلومات التي يصعب الحصول عليها بالتصوير البصري التقليدي.
خاصية أخرى مهمة للفلورة هي تحول ستوكس ، الفرق في الطول الموجي بين الإثارة وقمم الانبعاث (الشكل 2). عادة ما يكون الطول الموجي للضوء المنبعث أطول من الطول الموجي لضوء الإثارة. هذا لأنه بعد إثارة مادة الفلورسنت وقبل إطلاق الفوتون ، ستفقد الإلكترونات جزءًا من الطاقة من خلال عملية الاسترخاء. من السهل ملاحظة المواد الفلورية ذات التحولات الأكبر في ستوكس تحت مجهر التألق.
مجاهر الإسفار وكتل مرشح الإسفار
الفحص المجهري الفلوريسنت هو مجهر بصري يستخدم خصائص التألق للمراقبة والتصوير ، ويستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية ، وعلم الأعصاب ، وعلم النبات ، وعلم الأحياء الدقيقة ، وعلم الأمراض ، وعلم الوراثة وغيرها من المجالات. يتميز التصوير الفلوري بمزايا الحساسية العالية والنوعية العالية ، وهو مناسب جدًا لمراقبة توزيع البروتينات والعضيات المحددة وما إلى ذلك في الأنسجة والخلايا ، ودراسة التوطين المشترك والتفاعل ، وتتبع ديناميكية الحياة عمليات مثل التغيرات في تركيز الأيونات.
معظم الجزيئات في الخلايا لا تتألق ، ومن أجل رؤيتها ، يجب أن يتم تمييزها بالفلوريسنت. هناك العديد من طرق وضع العلامات الفلورية ، والتي يمكن تمييزها مباشرة (مثل استخدام DAPI لتسمية الحمض النووي) ، أو التلوين المناعي باستخدام خصائص ربط المستضد للأجسام المضادة ، أو يمكن تمييز البروتين المستهدف بالبروتينات الفلورية (مثل GFP ، الأخضر البروتين الفلوري) ، أو الارتباط القابل للانعكاس. الأصباغ الاصطناعية (مثل Fura -2) ، إلخ.
في الوقت الحاضر ، أصبح مجهر التألق معدات التصوير القياسية لمختلف المعامل ومنصات التصوير ، وهو مساعد جيد لتجاربنا اليومية. تنقسم مجاهر الإسفار بشكل أساسي إلى ثلاث فئات: مجاهر مضان منتصبة (مناسبة للتقطيع) ، مجاهر مضان مقلوبة (مناسبة للخلايا الحية ، مع مراعاة الأقسام) ، مجاهر مجسمة الفلورسنت (مناسبة للعينات الأكبر ، مثل النباتات ، الزرد (الكبار / الجنين) ، medaka ، فأر / فأر ، وما إلى ذلك).
كتلة مرشح الفلورة هي المكون الأساسي للتصوير الفلوري في المجاهر. وهو يتألف من مرشح إثارة ، ومرشح انبعاث ، وموزع شعاع مزدوج اللون. يتم تثبيته في عجلة التصفية ، مثل Leica DMi8 المجهزة 6- بعجلة تصفية الوضع (الشكل 3). ). المجاهر المختلفة لها مواضع مختلفة للعجلة ، وبعض المجاهر تستخدم شرائح الترشيح.
تلعب كتلة المرشح دورًا مهمًا في التصوير الفلوري: يقوم مرشح الإثارة باختيار ضوء الإثارة لإثارة العينة وحجب الأطوال الموجية الأخرى للضوء ؛ يمر الضوء الذي يمر عبر مرشح الإثارة عبر جهاز تقسيم شعاعي مزدوج اللون (يتمثل دوره في عكس ضوء الإثارة ونقل التألق) ، وبعد الانعكاس ، يتم تركيزه بواسطة العدسة الموضوعية ، ويتم تشعيعه إلى العينة ، ويتم تحفيز الفلورة المقابلة تنبعث منها الضوء. يتم جمع الضوء المنبعث بواسطة العدسة الشيئية ، ويمر عبر فاصل شعاع مزدوج اللون ، ويصل إلى مرشح الانبعاث. كما هو موضح في الشكل 4: الطول الموجي للإثارة هو 450-490 نانومتر ، ويعكس مقسم الحزمة ثنائية اللون الضوء الأقصر من 510 نانومتر ، وينقل الضوء الأطول من 510 نانومتر ، ونطاق استقبال الضوء المنبعث 520-560 نانومتر.
يمكن تقسيم مرشحات الإسفار المستخدمة بشكل شائع في مجاهر التألق إلى نوعين: التمرير الطويل (LP اختصارًا) والممر الشريطي (BP للاختصار). يتم تحديد ممر النطاق عادةً من خلال الطول الموجي المركزي وعرض الفاصل الزمني ، مثل 480/40 ، مما يعني أنه يمكن تمرير الضوء من 460-500 نانومتر. مرشحات Longpass ، مثل 515 LP ، تمرر الضوء بأطوال موجية أطول من 515 نانومتر (الشكل 5).
المواد الفلورية لها منحنى الإثارة (الامتصاص) المميز ومنحنى الانبعاث ، ذروة الإثارة هي الطول الموجي المثالي للإثارة (كفاءة الإثارة العالية ، والتي يمكن أن تقلل من طاقة ضوء الإثارة ، وتحمي الخلايا والأصباغ) ، ومنحنى الانبعاث هو الطول الموجي للانبعاث الفلوري نطاق. لذلك ، في التجربة ، سنختار الطول الموجي أقرب ما يمكن من ذروة الإثارة للإثارة ، ويجب أن يشمل نطاق الاستقبال ذروة الانبعاث. على سبيل المثال ، تبلغ ذروة الإثارة لـ Alexa Fluor 488 500 نانومتر ، ويمكن اختيار مرشح الإثارة 480/40 في مجهر التألق.
يمكن الاطلاع على تفاصيل مكعبات المرشح في برنامج التصوير المجهر. يعد فهم الأصباغ وإيجاد المرشح الذي يناسب عينتك أمرًا بالغ الأهمية للتصوير الفلوري. يشار إلى المعلومات الطيفية للأصباغ الفلورية والبروتينات الفلورية بشكل عام في التعليمات ، ويمكن أيضًا العثور عليها عبر الإنترنت.
بالإضافة إلى الإثارة وأطوال موجات الانبعاث لتحقيقات الفلورسنت ، فإن اختيار كتل المرشح يحتاج أيضًا إلى النظر في ما إذا كان هناك إثارة غير محددة وما إذا كان هناك لون متقاطع للعينات ذات العلامات متعددة الألوان. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري مراعاة مصدر ضوء الفلورسنت المستخدم. في الوقت الحاضر ، تشمل مصادر الإضاءة الفلورية الشائعة الاستخدام مصابيح الزئبق ومصابيح الهاليد المعدنية ومصادر ضوء LED التي تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة. طيف مصدر ضوء الفلورسنت مستمر أو متقطع ، وستكون الطاقة مختلفة في نطاقات أطوال موجية مختلفة. أصبح مصدر ضوء LED تدريجياً مصدر الضوء الرئيسي لمجهر التألق بسبب نطاقه الطيفي الضيق نسبيًا ، وإخراج الطاقة الأكثر استقرارًا ، والعمر الطويل ، وحماية البيئة الأكثر أمانًا والعديد من المزايا الأخرى.
بالإضافة إلى كتلة المرشح المدمجة في المجهر ، هناك أيضًا عجلة خارجية سريعة (الشكل 7). تبلغ سرعة تحويل المرشح المجاور للعجلة الخارجية السريعة لـ Leica 27 مللي ثانية ، والتي يمكنها تحقيق تجارب عالية السرعة متعددة الألوان ، مثل تصوير الكالسيوم بنسبة FRET و Fura2. (الشكل 8) وآخرون.
مجموعة متنوعة من تقنيات التصوير المجهري الفلوري
من أجل تلبية احتياجات التصوير المختلفة ، بالإضافة إلى المجاهر الفلورية ، تم تطوير العديد من حلول التصوير المجهري الفلوري:
تستخدم أنظمة التصوير عالية الدقة ذات المجال الواسع ، مثل Leica THUNDER Imager ، تقنية Clearing المبتكرة من Leica لإزالة إشارات تداخل المستوى غير البؤري بكفاءة أثناء التصوير ، وتقديم صور واضحة ومزايا التصوير عالي السرعة ؛
يستخدم مجهر المسح بالليزر المتحد البؤر ثقوبًا لإزالة تداخل المستوى غير البؤري ، وتحقيق التقسيم البصري ، والحصول على صور عالية الدقة وصور ثلاثية الأبعاد ؛
يمكن للمجاهر فائقة الدقة والمجاهر النانوية التي تخترق حد الانعراج أن تراقب الهياكل الدقيقة التي يقل حجمها عن 200 نانومتر ؛
نظام تصوير متعدد الفوتونات يستخدم مبدأ الإثارة المتعددة الفوتونات لتصوير الأنسجة السميكة والعميقة في الجسم الحي ؛
تقنية تصوير الألواح الضوئية ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية ، وسرعة التصوير السريعة ، والدقة العالية ، والسمية الضوئية المنخفضة ، ومناسبة بشكل خاص للبحث في مجال التطوير والمراقبة الديناميكية في الجسم الحي ؛
يمكن للتصوير مدى الحياة (FLIM) ، الذي لا يتأثر بعوامل مثل تركيز مادة الفلورسنت ، والتبييض الضوئي ، وشدة ضوء الإثارة ، وما إلى ذلك ، إجراء قياسات وظيفية ودقيقة أكثر عمقًا ؛
التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) والتحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCCS) ، يقيسان العدد الجزيئي ومعامل الانتشار للجزيئات الفلورية ، وبالتالي تحليل التركيز الجزيئي ، والحجم الجزيئي ، واللزوجة ، والحركة الجزيئية ، والترابط الجزيئي / التفكك ، والخصائص البصرية الجزيئية ؛
يعتبر مجهر الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) ، بدقة عالية للغاية للمحور z ، مثاليًا لدراسة التركيب الجزيئي وديناميكيات أسطح غشاء الخلية.
