الخصائص التقنية ومهارات الاستخدام لمجهر مضان ثنائي الفوتون
يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون تقنية جديدة تجمع بين الفحص المجهري متحد البؤر والمسح بالليزر وتكنولوجيا الإثارة ثنائية الفوتون.
المبدأ الأساسي للإثارة ثنائية الفوتون هو: في حالة كثافة الفوتون العالية ، يمكن للجزيئات الفلورية أن تمتص فوتونين بطول موجة طويلة في نفس الوقت ، وتصدر فوتونًا بطول موجي أقصر بعد فترة قصيرة مما يسمى بعمر الحالة المثير. . ؛ التأثير مماثل لاستخدام فوتون بطول موجي نصف طول موجي طويل لإثارة جزيء الفلورسنت. تتطلب الإثارة ثنائية الفوتون كثافة عالية من الفوتون. من أجل عدم إتلاف الخلايا ، يستخدم الفحص المجهري ثنائي الفوتون أشعة الليزر النبضية ذات الطاقة العالية. يحتوي الليزر المنبعث من هذا الليزر على ذروة عالية للطاقة ومتوسط طاقة منخفض ، وعرض النبضة لا يتجاوز 100 فمتوثانية ، ويمكن أن تصل مدته إلى 80 إلى 100 ميغا هرتز. عند استخدام عدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية لتركيز فوتونات الليزر النبضي ، تكون كثافة الفوتون عند النقطة المحورية للعدسة الموضوعية هي الأعلى ، والإثارة ثنائية الفوتون تحدث فقط عند النقطة المحورية للعدسة الشيئية ، لذلك لا يحتاج المجهر ثنائي الفوتون إلى ثقب متحد البؤر ، مما يحسن كفاءة الكشف عن الإسفار. إنها طريقة بحث مهمة في مجالات علم التشكل وبيولوجيا الخلية الجزيئية وعلم الأعصاب والصيدلة.
1. خلفية ظهور الفحص المجهري ثنائي الفوتون - اثنان من قيود الفحص المجهري التقليدي بالليزر متحد البؤر:
1) أحدهما هو ظاهرة السمية الضوئية: لأن الثقب متحد البؤر يجب أن يكون صغيرًا بما يكفي للحصول على صورة عالية الدقة ، وستحجب الفتحة الصغيرة جزءًا كبيرًا من التألق المنبعث من العينة ، بما في ذلك التألق المنبعث من المستوى البؤري ، المقابلة نعم ، يجب أن يكون ضوء الإثارة قويًا بدرجة كافية للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية ؛ وسيؤدي الليزر عالي الكثافة إلى تلاشي الصبغة الفلورية بسرعة أثناء المسح المستمر ، وستصبح إشارة الفلورسنت أضعف وأضعف مع تقدم المسح.
2) السمية الضوئية مشكلة أخرى. تحت إشعاع الليزر ، ستنتج العديد من جزيئات الصبغة الفلورية سموم خلوية مثل الأكسجين المفرد أو الجذور الحرة ، لذلك يجب أن يكون وقت المسح وكثافة الطاقة الضوئية لضوء الإثارة محدودًا في التجربة للحفاظ على كثافة العينة. نشيط. في البحث على العينات النشطة ، وخاصة المراحل المختلفة لنمو وتطوير العينات النشطة ، يجعل التبييض الضوئي والسمية الضوئية هذه الدراسات محدودة للغاية.
2. لماذا تقول إن المجاهر ثنائية الفوتون لا تحتاج عمومًا إلى أن تكون مجهزة بأشعة الليزر فوق البنفسجية؟
الفحص المجهري ثنائي الفوتون هو تقنية إثارة مضان تعتمد على تأثير الإثارة ثنائي الفوتون: يمكن إثارة جزيئات الصبغة الفلورية بامتصاص فوتونين منخفضي الطاقة في نفس الوقت (الفاصل الزمني بين فوتونين يصلان إلى جزيئات الفلورسنت أقل من 1 فيمتوثانية ) ، يمكن أن يكون تأثير الإثارة مكافئًا لامتصاص فوتون عالي الطاقة بطول موجي 1/2. على سبيل المثال ، امتصاص فوتونين بأطوال موجية حمراء يعادل جزيء يمتص الأشعة فوق البنفسجية. لا تمتص الخلايا الفوتونات طويلة الموجة بسهولة ، لذلك تقل السمية الضوئية للخلايا الحية ، كما يتم تقليل التبييض الضوئي. بهذه الطريقة ، لا تلعب وظيفة الإثارة فوق البنفسجية فحسب ، بل تتجنب أيضًا تلف الأشعة فوق البنفسجية للعينة.
3. ما الذي يميز ليزر المجهر ثنائي الفوتون؟
يعتمد احتمال امتصاص فوتونين على مدى تقارب الفوتونين الساقطين في المكان والزمان (يجب أن يصل الفوتونان في غضون 10-18 ثانية). المقطع العرضي لامتصاص الفوتونين صغير ، ولا يتم إثارة سوى الفلوروفور في المناطق ذات التدفق الفوتوني الكبير. لذلك ، فإن معظم أنواع الليزر المستخدمة هي ليزر الياقوت التيتانيوم ، والذي يمكن أن يحقق سرعات مسح ضوئي بيكو ثانية أو فيمتوثانية ، ولديه طاقة ذروة عالية للغاية ومتوسط طاقة منخفض ، بحيث يمكن تقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية أو القضاء عليهما. أهم شيء هو توفير كثافة عالية جدًا من الفوتونات في نطاق صغير ، والتي يمكن أن تضمن الإثارة المتزامنة لفوتونين.
4. ما هي مزايا الإثارة ثنائية الفوتون؟
1) زيادة انتقائية الصبغة: نطاق ضوء الإثارة لليزر متحد البؤر (Ar ، Ar / Kr ، HeNe) هو 488 نانومتر - 647 نانومتر. وهذا يعني تجربة الأصباغ المضيئة المفعمة بالأشعة فوق البنفسجية ، على سبيل المثال باستخدام DAPI و Hoescht. الطول الموجي المثير للفوتونين هو ضعف الطول الموجي للفوتون الواحد ، لذلك يمكن أن تثير الأصباغ التي تثيرها الأشعة فوق البنفسجية ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة.
2) تقليل التبييض الضوئي: بسبب انخفاض التبييض الضوئي ، يزداد معدل نجاح التجارب باستخدام CFP / YFP لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET).
3) ليست هناك حاجة إلى عدسة موضوعية خاصة: من وجهة نظر الأجهزة ، فإن إثارة الأصباغ المتحمسة للأشعة فوق البنفسجية مع الطول الموجي لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة لا تتطلب مكونات بصرية خاصة للأشعة فوق البنفسجية.
4) تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء: الطول الموجي للضوء المنبعث وطول موجة الضوء المنبعث لهما فرق كبير ، مما يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
5) التبييض المترجمة إلى النقطة المحورية: نظرًا لأن الإثارة الفلورية تحدث فقط عند النقطة المحورية للهدف ، فليست هناك حاجة لثقب متحد البؤر. هذا يحسن الكشف عن الضوء ويحدث التبييض الضوئي فقط في نقطة الاتصال.
6) أسهل لاختراق العينات: لا يتشتت ضوء الطول الموجي للأشعة تحت الحمراء بسهولة بواسطة الخلايا ويمكن أن يخترق عينات أعمق.
5. بالمقارنة مع الفحص المجهري متحد البؤر المسح بالليزر ، ما هو أكبر تحسن تم إجراؤه بواسطة الفحص المجهري ثنائي الفوتون؟
1) تقليل التبييض الضوئي.
2) انخفاض السمية الضوئية.
3) ليس من السهل التشتت ، كما أنه من الأسهل اختراق العينات السميكة ، مثل شرائح المخ.
