تقنيات التلوين والمراقبة المجهرية للكائنات الحية الدقيقة
1. الغرض
1.1 تعلم التقنيات الأساسية للمسحات الميكروبية وتلطيخ.
1.2 إتقان طريقة التلوين البسيطة للبكتيريا.
1.3 فهم المبدئي للخصائص المورفولوجية للبكتيريا ، ودمج معرفة كيفية استخدام عدسات الزيت وتقنيات التشغيل المعقمة.
2 المبادئ
يعد تلطيخ البكتيريا وتلطيخها تقنية أساسية في تجارب علم الأحياء الدقيقة. الخلايا البكتيرية صغيرة وشفافة، مما يجعل من الصعب التعرف عليها تحت المجهر الضوئي العادي؛ يجب أن تكون ملطخة. يتم استخدام صبغة واحدة لصبغ البكتيريا، بحيث تشكل البكتيريا الملطخة اختلافًا واضحًا في اللون عن الخلفية، بحيث يمكن ملاحظة مورفولوجيتها وبنيتها بشكل أكثر وضوحًا. هذه الطريقة سهلة التشغيل ومناسبة لمراقبة الشكل العام للخلايا البكتيرية وترتيب البكتيريا. تستخدم الأصباغ الأساسية بشكل شائع للتلوين البسيط. وذلك لأنه في المحاليل المحايدة أو القلوية أو الحمضية الضعيفة، عادة ما تكون الخلايا البكتيرية مشحونة سلبا، وعندما تتأين الأصباغ الأساسية، فإن الجزء الصباغي من جزيئاتها يكون مشحونا بشكل إيجابي، لذلك فهي قلوية. يتحد الجزء الملون من الصبغة بسهولة مع البكتيريا لتلوينها. تتباين الخلايا البكتيرية الملطخة بشكل حاد مع الخلفية، مما يسهل التعرف عليها تحت المجهر. تشمل الأصباغ المستخدمة عادة للصباغة البسيطة أزرق الميثيلين، والبنفسجي البلوري، والفوشسين الأساسي، وما إلى ذلك. عندما تحلل البكتيريا السكريات وتنتج حمضًا، مما يتسبب في انخفاض الرقم الهيدروجيني للوسط المزروع، تزداد الشحنة الموجبة على البكتيريا. في هذا الوقت، يمكن استخدام الأصباغ الحمضية مثل الأيوسين أو حمض الفوشين أو أحمر الكونغو للتلوين. يجب أن تكون ثابتة البكتيريا قبل تلطيخ. وله غرضان: الأول هو قتل البكتيريا وجعلها تلتصق بالشريحة الزجاجية؛ والآخر هو زيادة تقاربهم للأصباغ. هناك طريقتان شائعتان الاستخدام هما التسخين والتثبيت الكيميائي. عند التثبيت، حاول الحفاظ على الشكل الأصلي للخلايا.
3 مواد
3.1 البكتيريا: البكتيريا العصوية الرقيقة 12-18h زراعة الآجار المغذي المائل، المكورات العنقودية الذهبية زراعة الآجار المائل 24 ساعة، الإشريكية القولونية زراعة الآجار المائل 24 ساعة، زراعة أجار خميرة الخباز المائلة.
3.2 عامل الصباغة: صبغة الميثيلين الزرقاء القلوية (أو صبغة البنفسج الكريستالية لأكسالات الأمونيوم) وصبغة الفوشسين حمض الكربوليك.
3.3 الأدوات أو الأدوات الأخرى: المجهر، مصباح الكحول، الشريحة، حلقة التلقيح، رف الشريحة، زجاجة مزدوجة الطبقة (تحتوي على زيت الأرز والزيلين)، أنسجة العدسة، المياه المالحة الفسيولوجية أو الماء المقطر، إلخ.
4. العملية: اللطاخة ← التجفيف ← التثبيت ← تلطيخ ← الغسيل ← التجفيف ← الفحص المجهري.
5 خطوات
5.1 تشويه: خذ شرائح زجاجية نظيفة وخالية من الزيت. في ظل ظروف معقمة ، ضع قطرة صغيرة من المالحة العادية (أو الماء المقطر) على كل مركز من الشريحة الزجاجية. استخدم حلقة التلقيح لتعقيم البكتيريا العصوية الرقيقة. ، Micrococcus luteus و Escherichia coli ، اختر العشب البكتيري الصغير في قطرات الماء على المائل ، ويُختلط جيدًا ويضعه في فيلم رفيع. إذا كنت تستخدم تشطيب التعليق البكتيري (أو الثقافة السائلة) ، فيمكنك استخدام حلقة تطعيم لاختيار 2 إلى 3 حلقات وتطبيقها مباشرة على الشريحة. احرص على عدم إسقاط الكثير من المالحة الفسيولوجية (الماء المقطر) وإزالة البكتيريا وتطبيقه بالتساوي وليس كثيفًا جدًا.
5.2 التجفيف يجفف بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة. يمكنك أيضًا تسخينه قليلاً فوق مصباح الكحول مع الجانب المطلي في مواجهة لتجفيفه. ولكن تأكد من عدم الاقتراب من اللهب ، حيث أن درجة الحرارة المرتفعة للغاية ستدمر مورفولوجيا البكتيريا.
5.3 التثبيت إذا تم استخدام التجفيف الساخن، يتم دمج التثبيت والتجفيف في خطوة واحدة، وتكون الطريقة هي نفس طريقة التجفيف. مسحة وجافة وقابلة للإصلاح بالحرارة.
5.4 تلطيخ: ضع الشريحة بشكل مسطح على حامل الشرائح، وأضف قطرة أو قطرتين من محلول الصبغة على اللطاخة (من المناسب أن يغطي محلول الصبغة طبقة اللطاخة فقط). وصمة عار مع الميثيلين الأزرق الأساسي لمدة 1 إلى 2 دقيقة، وصمة عار مع حمض الكربوليك الفوشين (أو البنفسجي الكريستال أكسالات الأمونيوم) لمدة دقيقة واحدة تقريبا.
5.5 الغسيل بالماء: صب محلول الصبغة وشطفه برفق بماء الصنبور من أحد طرفي الشريحة حتى يكون الماء يركض من اللطخة عديمة اللون. عند الغسيل بالماء، لا تغسل السطح المطلي مباشرة بالماء. يجب ألا يكون تدفق المياه سريعًا جدًا أو كبيرًا جدًا لمنع السقوط من السقوط.
5.6 التجفيف: قم بالتخلص من قطرات الماء على الشريحة وتجف بشكل طبيعي ، وينفخ جافًا مع مجفف شعر أو امتصاصه بورق ماصة (احرص على عدم مسح البكتيريا). 5.7 الفحص المجهري بعد اللطاخات جافة ، وإجراء الفحص المجهري. يجب أن تكون اللطاخة جافة تمامًا قبل مشاهدتها بعدسة زيتية.
6 النتائج ارسم مورفولوجية الإشريكية القولونية والمكورات الصفراء التي تمت ملاحظتها بعد تلطيخها مرة واحدة.
