مبادئ الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر (LSCM)
يستخدم مجهر الليزر متحد البؤر ثقبًا صغيرًا للإضاءة يوضع خلف مصدر الضوء وثقبًا للكشف يوضع أمام الكاشف لتحقيق إضاءة النقطة واكتشاف النقاط. يتم تركيز الضوء من مصدر الضوء على نقطة في المستوى البؤري للعينة عن طريق الضوء المنبعث من خلال ثقب الإضاءة، ويتم تصوير الفلورسنت المنبعث من تلك النقطة داخل ثقب الكشف، ويتم حجب أي ضوء منبعث خارج تلك النقطة بواسطة ثقب الكشف. يتم ربط ثقب الإضاءة وثقب الكشف بالنقطة المضيئة أو المكتشفة، بحيث تكون النقطة المكتشفة هي نقطة البؤر والمستوى الذي تقع فيه النقطة المكتشفة هو المستوى البؤري. يقوم الكمبيوتر بعرض النقطة المكتشفة على شاشة الكمبيوتر على شكل نقطة صورة. من أجل إنتاج صورة كاملة، يقوم نظام المسح في المسار البصري بمسح المستوى البؤري للعينة، وبالتالي إنتاج صورة متحد البؤر كاملة. وطالما يتم تحريك المرحلة الحاملة لأعلى ولأسفل على طول المحور Z، يتم نقل مستوى جديد من العينة إلى المستوى البؤري، ويتم تصوير المستوى الجديد للعينة على الشاشة، بينما يستمر المحور Z في التحرك عند التحرك، يتم الحصول على صور متتالية مقطوعة بالضوء لمستويات مختلفة من العينة.
يستخدم المجهر الضوئي التقليدي مصدر ضوء المجال، وسوف تتداخل صورة كل نقطة على العينة من خلال حيود أو تشتت الضوء من النقاط المجاورة؛ يستخدم المجهر متحد البؤر المسح بالليزر شعاع الليزر من خلال الثقب المضيء لتشكيل مصدر ضوء نقطي على العينة الممسوحة ضوئيًا عند كل نقطة من المستوى البؤري الداخلي، والعينة على النقطة المشععة، وتصوير ثقب الثقب، عن طريق الكشف عن الثقب بعد تلقي نقطة أنبوب مضاعفة الضوء (PMT) أو الجهاز الكهربائي البارد (cCCD) نقطة بنقطة أو سطرًا تلو الآخر، يتم تشكيل صورة الفلورسنت بسرعة على شاشة شاشة الكمبيوتر. ثقب الإضاءة وثقب الكشف بالنسبة إلى المستوى البؤري للعدسة الموضوعية مترافقان، والنقطة على المستوى البؤري في نفس الوقت تركز على ثقب الإضاءة وثقب الانبعاث، والنقطة خارج المستوى البؤري لن تكون في الكشف عن الثقب في التصوير، بحيث تكون الصورة البؤرية التي تم الحصول عليها هي المقطع العرضي البصري للعينة، والتغلب على عيوب صورة المجهر العادية الغامضة.
من المبدأ الأساسي، مجهر الليزر متحد البؤر هو مجهر بصري حديث، وهو مجهر الضوء العادي من التكنولوجيا لإجراء التحسينات التالية.
1. استخدم الليزر كمصدر للضوء لأن أحادية اللون لليزر جيدة جدًا، والطول الموجي لشعاع مصدر الضوء هو نفسه، مما يزيل الانحراف اللوني بشكل أساسي.
2. استخدام تقنية البؤر في المستوى البؤري للعدسة الموضوعية الموضوعة في المنتصف مع ثقب صغير في الحاجز، والمستوى البؤري خارج حجب الضوء الشارد، والقضاء على الانحراف الكروي؛ ومواصلة القضاء على الانحراف اللوني.
3. مجهر ليزر متحد البؤر يستخدم تقنية المسح النقطي لتحليل العينة إلى مساحة ثنائية أو ثلاثية الأبعاد إلى نقاط لا حصر لها، مع شعاع ليزر صغير جدًا (مصدر ضوء نقطي) نقطة بنقطة، ومسح التصوير سطرًا تلو الآخر، ثم من خلال مزيج الحواسيب الصغيرة من مستوى كامل أو صورة ثلاثية الأبعاد. المجهر الضوئي التقليدي هو مصدر ضوء مجالي تحت التصوير لمرة واحدة، وستكون العينات الموجودة في كل نقطة من الصورة مجاورة لنقطة الضوء المنحرف وتداخل الضوء المتناثر. لا يمكن مقارنة وضوح ودقة هاتين الصورتين.
4. الحصول على الإشارات الضوئية ومعالجتها بالكمبيوتر وتضخيم الإشارات باستخدام أنبوب المضاعف الضوئي
في المجهر الليزري متحد البؤر، يحل الكمبيوتر محل العين البشرية أو الكاميرا للمراقبة وتسجيل الفيديو، ويتم رقمنة الصور التي تم الحصول عليها ويمكن معالجتها في الكمبيوتر لتحسين وضوح الصور مرة أخرى. علاوة على ذلك، فإن استخدام أنابيب المضاعف الضوئي يمكن أن يؤدي إلى تضخيم الإشارات الضعيفة جدًا، مما يؤدي إلى تحسين الحساسية بشكل كبير. نتيجة للاستخدام المشترك للتقنيات المذكورة أعلاه، يمكن القول أن LSCM هو المجهر الأكثر تقدمًا في العالم. يمكن القول أن LSCM عبارة عن مزيج من تكنولوجيا إنتاج المجهر والتكنولوجيا الكهروضوئية وتكنولوجيا الكمبيوتر **، وهو المنتج الحتمي لتطور التكنولوجيا الحديثة.
