قسم التصوير المجهري 丨 تطبيق الفحص المجهري الفلوري
الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) هو تقنية تستخدم الموجة الزائلة الناتجة عن شعاع ضوئي ينتشر بين وسيطين مختلفين لمؤشر الانكسار لاستكشاف سطح الخلايا الحية ذات العلامات الفلورية. من الناحية العملية ، عندما يواجه شعاع الليزر الساقط الواجهة بين الغطاء والوسط المائي الذي يحتوي على الخلايا ، فإنه ينعكس في الزاوية الحرجة (الانعكاس الداخلي الكلي). نظرًا لأن طاقة الموجة الزائلة تتناقص بشكل كبير مع المسافة من الغطاء ، فإن الفلوروفور فقط في نطاق 10 نانومتر من السطح (بين 10 و 200 نانومتر) يتم تحفيزها بواسطة الموجة الزائلة ، بينما تكون الفلوروفورات البعيدة غير متحمسة إلى حد كبير. متأثر. وبالتالي ، ينتج عن TIRFM مستويات إشارة عالية من الفلوروفورات الموجودة بالقرب من ساترة ، متراكبة على خلفية مظلمة للغاية ، مما يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء ممتازة. يعتبر التحديد الشديد لعمق الإثارة مثاليًا لدراسة الجزيئات المفردة أو تكوين الغشاء والعضيات في الخلايا الملتصقة بالقرب من سطح الغطاء (انظر الشكل 8 (هـ)). نظرًا لأن الإثارة تقتصر على المناطق الرقيقة بالقرب من الغطاء ، فإن التبييض الضوئي والسمية الضوئية يقتصران أيضًا على هذه المناطق ، مما يجعل TIRFM واحدة من أكثر الطرق المفيدة للمراقبة طويلة المدى. أصبحت هذه التقنية أداة أساسية لدراسة مجموعة واسعة من الظواهر في الخلية والبيولوجيا الجزيئية.
Deconvolution عبارة عن خوارزمية مطبقة على مجموعة من الصور ذات التركيز البؤري الكامل التي تم الحصول عليها على طول المحور البصري (Z) لتعزيز إشارة الفوتون في مجموعة من الصور لمستوى صورة معين أو مستويات بؤرية متعددة. يجب أن تكون المجاهر مجهزة بمحركات تركيز عالية الدقة بمحركات لضمان الحصول على الصورة في فترات زمنية محددة بدقة بين المستويات البؤرية للعينة. في تطبيق نموذجي (انظر الشكل 8 (و)) ، تُستخدم عملية deconvolution لإفساد وإزالة الضوء الخارج عن التركيز من مستوى بؤري معين باستخدام إثارة وانبعاث مضان واسع النطاق. التطبيق الأكثر تعقيدًا هو تطبيق عملية deconvolution على مجموعة الصور بأكملها لإنشاء عروض مسقطة أو نماذج ثلاثية الأبعاد. تلتقط مجموعة من الصور ذات المجال العريض المستخدمة في deconvolution الحد الأقصى النظري لعدد الفوتونات المنبعثة من العينة. تعيد عملية deconvolution توزيع شدة الفوتونات "غير الواضحة" المنبعثة أعلى وأسفل المستوى البؤري إلى المستوى الأصلي. وبالتالي ، يستخدم deconvolution جميع شدة الانبعاث المتاحة تقريبًا ويوفر ميزانية ضوئية مثالية ، مما يجعل هذه التقنية هي الطريقة المفضلة للعينات شديدة الحساسية للضوء.
يتم استخدام متغير لظاهرة نقل طاقة الرنين في الفحص المجهري الفلوري أو الفلورة أو نقل طاقة الرنين فورستر (FRET) للحصول على معلومات زمنية ومكانية كمية حول ارتباط وتفاعل البروتينات والدهون والإنزيمات والأحماض النووية في الخلايا الحية. يمكن لـ FRET استخدام تقنيات الحالة الثابتة أو تقنيات حل الوقت ، لكن تصوير FRET الذي تم حله بمرور الوقت يتميز بميزة رسم خرائط أكثر دقة لمسافات المتبرعين والمقبولين. يمكن استخدام مجهر مضان ذو نطاق واسع قياسي مزود بمرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة وكاميرا حساسة لتصوير الحنق. تُستخدم حاليًا المستشعرات الحيوية التي تحوي بروتينًا أو ببتيدًا حساسًا بيئيًا بين اثنين من البروتينات الفلورية القابلة للتطبيق في FRET على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية. يتم تصوير هذه المجسات بسهولة تحت الفحص المجهري واسع المجال باستخدام تقنيات انبعاث FRET المحسّنة جنبًا إلى جنب مع تحليل قياس النسب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد التصوير الطيفي والفك الخطي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر المسح بالليزر في مراقبة ظواهر FRET في أجهزة الاستشعار الحيوية وتطبيقات البروتين الفلوريسنت الأخرى.
التصوير المجهري مدى الحياة (FLIM) هو تقنية متطورة قادرة على تسجيل عمر التألق والموقع المكاني للفلوروفور في كل مكان في الصورة في وقت واحد. توفر هذه الطريقة آلية لدراسة المعلمات البيئية مثل الأس الهيدروجيني والتركيز الأيوني وقطبية المذيبات والتفاعلات غير التساهمية واللزوجة وتوتر الأكسجين في الخلايا الحية المفردة وتقدم البيانات في المصفوفات المكانية والزمانية. قياسات FLIM لأعمار الحالة المثارة على مقياس نانوثانية مستقلة عن تركيزات الفلوروفور المحلية ، وتأثيرات التبييض الضوئي ، وطول المسار (سمك العينة) ، ولكنها حساسة لتفاعلات الحالة المثارة مثل نقل طاقة الرنين. في الواقع ، يعتبر الجمع بين FLIM و FRET من خلال مراقبة تغييرات عمر المتبرعين الفلوريسنت قبل وبعد نقل طاقة الرنين أحد أفضل الطرق لدراسة هذه الظاهرة.
يمكن تحديد التنقل (معامل الانتشار المستعرض) للجزيئات الكبيرة ذات العلامات الفلورية والفلوروفورات الصغيرة عن طريق استعادة التألق بعد تقنية التبييض الضوئي (FRAP). في FRAP ، يتم إضاءة منطقة صغيرة جدًا محددة (قطرها بضعة ميكرومتر) بشكل مكثف ، عادةً باستخدام الليزر ، لإنتاج تبييض ضوئي كامل للفلوروفور في تلك المنطقة. والنتيجة هي انخفاض كبير في التألق أو القضاء عليه. بعد نبضة التبييض الضوئي ، تم رصد معدل ومدى استعادة كثافة التألق في المناطق المبيضة كدالة للوقت في شدة الإثارة المنخفضة لتوليد معلومات حول حركية إعادة التكاثر والانتعاش بالفلوروفور (الشكل 9). عادة ما يتم إجراء FRAP باستخدام EGFP أو غيرها من البروتينات الفلورية. تعتمد تقنيات التنشيط الضوئي ذات الصلة على فلوروفورات اصطناعية خاصة أو بروتينات فلورية وظيفية مماثلة يمكن تنشيطها بنبضات قصيرة من الأشعة فوق البنفسجية أو البنفسجي. يمكن استخدام التنشيط الضوئي و FRAP كتقنيات تكميلية لتحديد معلمات التنقل.
في تقنية مرتبطة بـ FRAP ، تسمى فقدان التألق بعد التبييض الضوئي (FLIP) ، تخضع منطقة الفلورسنت المحددة داخل الخلية الحية لتبييض ضوئي متكرر عن طريق التشعيع الشديد. إذا كانت جميع الفلوروفورات قادرة على الانتشار في المنطقة التي يتم تبييضها ضوئيًا خلال الفترة الزمنية التي تم قياسها ، فسيؤدي ذلك إلى فقد كامل لإشارة الفلورسنت في جميع أنحاء الخلية. من خلال حساب المعدل الذي يختفي عنده التألق من الخلية بأكملها ، يمكن تحديد قابلية الحركة المنتشرة للفلوروفور المستهدف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ FLIP تحديد موقع وطبيعة أي حواجز انتشارية بين الأجزاء الفردية للخلايا ، مثل الحاجز بين سوما ومحور عصبون.
يعد التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، المستخدم بشكل أساسي في الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر أو الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، طريقة مصممة لتحديد المعلومات الحركية مثل معدلات التفاعل الكيميائي ومعاملات الانتشار وتقنيات الوزن الجزيئي ومعدل التدفق والتجميع. في FCS ، يضيء حجم صغير (مقياس فيمتومتر واحد تقريبًا ؛ تركيز الليزر المحدود الانعراج) بشعاع ليزر مركّز لتسجيل تقلبات شدة التألق الذاتي التي تحدثها ديناميكيات جزيئات الفلورسنت كدالة للوقت في الحجم الذي يشغله الفلورسنت جزيئات (الشكل 10). تنتشر الفلوروفورات الصغيرة نسبيًا بسرعة في الحجم المضيء ، مما ينتج عنه دفعات قصيرة من الكثافة العشوائية. على العكس من ذلك ، فإن المجمعات الأكبر (الفلوروفورات المرتبطة بالجزيئات الكبيرة) تتحرك ببطء أكثر ، مما ينتج عنه أنماط شدة مضان أطول وأكثر ثباتًا تعتمد على الوقت.
عندما تكون الهياكل ذات العلامات الفلورية معبأة بكثافة وتتداخل في مناطق معينة من الخلايا الحية ، يصعب تحليل ديناميكياتها وتوزيعها المكاني. يعد الفحص المجهري الموضعي الفلوري (FSM) تقنية متوافقة مع جميع طرائق التصوير تقريبًا التي تستفيد من التركيزات المنخفضة جدًا للوحدات الفرعية ذات العلامات الفلورية ، وتقلل من التألق خارج التركيز ، وتحسن رؤية الهياكل ذات العلامات ودينامياتها في المناطق السميكة. يتم تنفيذ ولايات ميكرونيزيا الموحدة عن طريق وضع العلامات على جزء بسيط فقط من هيكل الفائدة بأكمله. وبهذا المعنى ، فإن ولايات ميكرونيزيا الموحدة تشبه أداء FCS على مجال الرؤية بأكمله ، على الرغم من أنها تركز بشكل أكبر على الأنماط المكانية بدلاً من التحليل الزمني الكمي. يعد الفحص المجهري البقعي الفلوري مفيدًا بشكل خاص في تحديد تنقل وتجميع عناصر الهيكل الخلوي مثل الأكتين والأنابيب الدقيقة في الخلايا مفرطة النشاط.
المجهر المحفز لاستنفاد الانبعاث (STED) هو تقنية ناشئة فائقة الدقة ذات دقة مكانية تتجاوز بكثير حد الانعراج ، باستخدام ضوء مستنفد على شكل حلقة لإحاطة شعاع أصغر من ضوء الإثارة للحصول على -50 نانومتر على المحور الحل. تعتمد هذه التقنية على إثارة الفلوروفور مع نبضات الليزر المتزامنة ونبضات STED الدائرية المنسقة مكانيًا والتي تستنفد الضوء المنبعث ، مما يمنع تألق الجزيئات المُثارة حول تركيز المسح بالليزر. يتم قمع الإسفار المتولد في محيط البقعة ، ولكن ليس في مركز البقعة ، وبالتالي تقليل حجم بقعة الفلورسنت بشكل كبير وبالتالي زيادة الدقة بشكل كبير. أثبتت STED أنها أداة مفيدة للكشف عالي الدقة عن الخلايا الحية. ستصبح تقنيات الدقة الفائقة الناشئة الأخرى ، مثل الفحص المجهري للتوطين الضوئي (PALM) والفحص المجهري للإضاءة الضوئية المنظمة (SIM) ، أدوات أساسية لتصوير الخلايا الحية في المستقبل القريب.
يفتح الاستخدام المتزايد للبروتينات الفلورية المشفرة وراثيًا والفلوروفورات الاصطناعية المتقدمة لتصوير الخلايا الحية الباب لطرائق بصرية جديدة لمراقبة الديناميات الزمنية والعلاقات المكانية. يمتلك المجهرون الآن مجموعة كاملة من الأدوات لمراقبة وتسجيل بيانات الصور للعمليات الخلوية التي تحدث على مدى واسع من النطاقات الزمنية وبدقة متعددة. يمكن ملاحظة الأحداث الأبطأ وتسجيلها بسهولة باستخدام الفحص المجهري المسح بالليزر ، بينما يمكن الحصول على الأحداث الحركية الأسرع باستخدام تقنية القرص الدوار. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح الفحص المجهري متعدد الفوتونات التصوير العميق في الأنسجة السميكة ، وتمكن تقنيات الانعكاس الداخلي الكلية من فحص أسطح الأغشية بدقة متحد البؤر. يمكن استخدام طرق التألق المتقدمة ، مثل FRET و FLIM و FRAP و FCS و FSM و SIM و PALM و STED ، لمراقبة تفاعلات البروتين والبروتين بدقة غالبًا أفضل من تلك المسموح بها بواسطة حد الانعراج. مع التقدم في تكنولوجيا الفلوروفور والميكروسكوب والكاشف ، سيتم وضع عالم أوسع "تحت المجهر".
