طرق توسيع العمق البؤري للمجاهر متعددة الفوتون
يعد الجمع بين اثنين من مجهر المسح الضوئي بالليزر-ومؤشر الكالسيوم هو المعيار الذهبي للكشف عن الإشارات العصبية داخل الجسم الحي. يتم توزيع الخلايا العصبية في الشبكات العصبية في مساحة ثلاثية الأبعاد-وتتطلب مراقبة ديناميكيات نشاطها طريقة لتحسين معدل التصوير الحجمي بسرعة. ومع ذلك، باستخدام مجهر مسح متعدد الفوتون لتصوير عدد كبير من الصور، إذا تم استخدام هدف فتحة رقمية عالية (NA) لتحقيق دقة جانبية أعلى، فسوف يؤدي ذلك إلى عمق بؤري أصغر. من أجل الحصول على تصوير حجمي على عمق بؤري صغير،
من الضروري إجراء مسح للمحور Z-من خلال بعض الوسائل، وتصوير العديد من المستويات عن طريق مسح كل مستوى بؤري، مما يحد بشكل كبير من سرعة التصوير. إذا كان من الممكن التضحية بمعلومات الصورة المحورية وإمكانية إجراء مسح حجمي في مسح جانبي واحد عن طريق توسيع عمق التركيز، أي أنه يتم عرض معلومات الحجم على صورة ثنائية الأبعاد واحدة، فيمكن تحسين سرعة التصوير بشكل كبير. وهذا ما يسمى تصوير عمق التركيز الممتد (EDF)، وهو مفيد بشكل خاص لتصوير الهياكل السكانية المتناثرة التي تتطلب دقة زمنية عالية، مثل التصوير الوظيفي لنشاط الخلايا العصبية.
يتم تحديد الدقة المحورية والجانبية للمجهر بواسطة الفتحة العددية (NA) للعدسة الموضوعية. يمكن أن يؤدي ارتفاع NA إلى زيادة الدقة المحورية والجانبية إلى الحد الأقصى بالإضافة إلى كمية الضوء المجمعة؛ سيؤدي انخفاض NA إلى دقة محورية أقل، أي عمق أطول للتركيز، ولكن في نفس الوقت يضحي بالدقة الجانبية وكفاءة جمع الضوء. يمكن لطريقة توسيع عمق التركيز البؤري التي سيتم تقديمها بعد ذلك تحقيق ذلك مع الحفاظ على الدقة الجانبية العالية وتدفق الضوء الكافي.
يمكن أن يؤدي استخدام مُعدِّلات الضوء المكانية لتوليد حزم Bessel النحيلة إلى تحقيق تصوير EDF، لكن مُعدِّلات الضوء المكانية ضخمة الحجم ويصعب توافقها مع مساحات المجهر الضيقة؛ في المقابل، تعتبر وحدات بيسل المعتمدة على الأهرامات المحورية رخيصة ومدمجة، لكنها لا تستطيع سوى توليد نقاط بؤرية ذات عمق ثابت وليست مناسبة للتجارب المختلفة التي تتطلب تغييرات مستمرة في العمق البؤري. لمعالجة هذه المشكلة، في عام 2018، RONGWEN LU et al. أظهر وحدة Bessel المستندة إلى محور، حيث تحتاج عدسة واحدة فقط إلى الترجمة على طول المحور البصري لضبط الطول المحوري لنقطة محورية Bessel بشكل مستمر.
الشكل 1 (أ) مخطط جهاز وحدة Bessel ؛ (ب) تم قياس وظيفة انتشار النقطة بشكل تجريبي عندما كان D -12 مم، 0 مم، و12 مم، على التوالي؛ (ج) العلاقة بين العرض الكامل الجانبي بنصف الحد الأقصى، (د) العرض الكامل المحوري بنصف الحد الأقصى، (هـ) إشارة الذروة، و (و) الطاقة البصرية خلف العدسة الموضوعية مع إزاحة L2 D
يظهر الشكل 1 أ جهاز الوحدة النمطية لتشكيل نقطة محورية متغيرة الطول من Bessel. يتشكل شعاع غاوس الساقط على شكل شعاع دائري بعد مروره عبر محور عصبي وعدسة L1. يمكن لقناع الفتحة الدائرية اللاحق أن يحجب الضوء الشارد الناتج عن عيوب المحور، وبالتالي تشكيل التوزيع المحوري لوظيفة انتشار نقطة إثارة الفوتون -. بعد ذلك، يتم تسليط شعاع الضوء على الجلفانومتر بواسطة العدسات L2 وL3، ومن ثم يصل إلى المستوى البؤري الخلفي للعدسة الموضوعية من خلال العدسات L4 وL5.
تشبه هذه التصميمات الوحدات الهرمية التقليدية، مع اختلاف يتمثل في أنه من خلال تحريك L2 أو L3 على طول المحور البصري، يمكن تعديل الطول المحوري لتركيز Bessel بشكل مستمر. يوضح الشكل 1 ب وظائف انتشار النقطة المحورية لقيم D البالغة -12 مم و0 مم و12 مم، مع عرض كامل محوري بنصف الحد الأقصى 39؟ م،24؟ م و14؟ م. كما هو موضح في الشكل 1c-f، فإن تحريك العدسة L2 من اليسار إلى اليمين يمكن أن يغير العرض الكامل بشكل مستمر بنصف الحد الأقصى في كلا الاتجاهين العرضي والمحوري، مما يعني أنه يمكن تغيير عمق التركيز بشكل مستمر. نتائج المحاكاة العددية المبنية على نظرية حيود المتجهات تتفق بشكل جيد مع البيانات التجريبية. يتحقق الشكل 2 من تأثير التصحيح لأحجام مختلفة من الأقنعة الحلقية على عيوب المحور. لقد وجد أن الأقنعة الحلقية الأرق يمكنها تحسين توزيع الكثافة المحورية لشعاع Bessel الناتج بشكل أفضل، ولكنها في الوقت نفسه تؤدي أيضًا إلى المزيد من فقدان الطاقة.
