تم تعزيز فوائد الفحص المجهري متعدد الفوتون بالليزر
يعد المجهر متعدد الفوتون للمسح بالليزر تحسينًا كبيرًا في المجهر الضوئي، وخاصة في القدرة على مراقبة البنية العميقة للخلايا والأنسجة الحية والثابتة، والحصول على هياكل مستوية Z واضحة وحادة ومتعددة الطبقات، أي الشرائح الضوئية، التي يمكن منها ويمكن بناء هيكل صلب ثلاثي الأبعاد للعينة. يستخدم الفحص المجهري متحد البؤر مصدر ضوء ليزر يتم توسيعه لملء المستوى البؤري الخلفي بالكامل للعدسة الشيئية، ثم يمر عبر نظام العدسة للعدسة الشيئية ليتقارب في نقاط صغيرة جدًا على المستوى البؤري للعينة. اعتمادًا على الفتحة العددية للعدسة الموضوعية، يبلغ حجم قطر نقطة الإضاءة الساطعة حوالي 0.25 ~ 0.8 ميكرومتر والعمق حوالي 0.5 ~ 1.5 ميكرومتر. يتم تحديد حجم نقطة البؤر من خلال تصميم المجهر، والطول الموجي لليزر، وخصائص العدسة الموضوعية، وإعداد حالة وحدة المسح الضوئي وطبيعة العينة. تحتوي المجاهر الميدانية على نطاق إضاءة كبير وعمق إضاءة، في حين تركز المجاهر متحد البؤر الإضاءة على نقطة بؤرية واحدة على المستوى البؤري. الميزة الأساسية للمجهر متحد البؤر هي القدرة على عمل مقاطع بصرية دقيقة من عينات الفلورسنت السميكة (تصل إلى 50 ميكرومتر أو أكثر)، بسماكة مقطع تبلغ حوالي 0.5 إلى 1.5 ميكرومتر. يمكن الحصول على سلسلة من صور المقطع البصري عن طريق تحريك العينة لأعلى ولأسفل باستخدام محرك السائر ذو المحور Z الخاص بالمجهر. يتم التحكم في الحصول على معلومات الصورة في المستوى الأول ولا يتداخل مع الإشارات المنبعثة من مواقع أخرى على العينة. بعد إزالة تأثيرات مضان الخلفية وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، تم تحسين تباين ودقة الصورة البؤرية بشكل ملحوظ مقارنة بصور الفلورسنت التقليدية ذات الإضاءة الميدانية. في العديد من العينات، تتشابك العديد من المكونات الهيكلية المعقدة لتشكل أنظمة معقدة، ولكن بمجرد الحصول على ما يكفي من المقاطع البصرية، يمكننا إعادة بنائها في ثلاثة أبعاد باستخدام البرمجيات. وقد استخدمت هذه الطريقة التجريبية على نطاق واسع في البحوث البيولوجية لتوضيح العلاقات الهيكلية والوظيفية المعقدة بين الخلايا أو الأنسجة.
