الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر - الميزات والتطبيقات
الفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر (LSCM) هو نوع من المجهر المصمم بناءً على تقنية التركيز المترافق، أي أن مصدر ضوء الليزر والعينة المراد قياسها والكاشف كلها في مواقع مترافقة مع بعضها البعض.
أساسي
في المجهر العام، يتم عزل مستوى الصورة من الملاحظة عن المستوى المحوري المجاور عن طريق تزامن المستوى البؤري للعدسة الموضوعية مع الكاشف، بينما في المجهر متحد البؤر، يتم استخدام بقعة ضوء محدودة الحيود لإضاءة العينة و يتم استخدام الثقب في مسار الضوء المجمع عند التركيز المقترن لبقعة الضوء لتصفية الضوء الشارد لإنشاء تأثير العزل وبالتالي تحسين الدقة.
ميزات التصوير
تصوير المقطع البصري
ميزة أخرى للمسح المجهري متحد البؤر بالليزر هي أنها تقنية مسح وتصوير. تضيء تقنية الإضاءة واسعة المجال التقليدية العينة بأكملها، بحيث يمكن التقاط الصورة مباشرة بالعين المجردة أو الكاشف، لكن LSCM يستخدم شعاعًا أو حزمًا مركزة متعددة تمر عبر العينة للمسح الضوئي والصورة. تسمى الصورة الناتجة قسم بصري. يوضح ما يلي الفرق بين طريقة الإضاءة التقليدية واسعة المجال وطريقة الإضاءة البؤرية للمسح بالليزر.
لذلك، فإن طريقة العمل الفعلية للمجهر متحد البؤر الحديث هي كما هو مبين في الشكل أدناه. يمر ضوء الإثارة المنبعث من الليزر عبر مرآة مزدوجة اللون ويتم مسحه ضوئيًا في الاتجاه x والاتجاه y للعينة من خلال زوج من الجلفانومتر. الإثارة (أو الانعكاس) للعينة هي أن الضوء يدخل إلى كاشف PMT من خلال الثقب ويتم تسجيله، ويتم إعادة بناء الصورة الممسوحة ضوئيًا المسجلة بواسطة جهاز كمبيوتر لإعادة بناء صورة العينة الفعلية.
إنشاء صور "z-stack" على مستويات بؤرية مختلفة
فقط الضوء المنعكس من طبقة العينة المترافقة يمكن أن يمر عبر الثقب الصغير في مسار ضوء التجميع، ويتم حظر انعكاسات طبقة العينة المتبقية غير ذات الصلة بواسطة الثقب الصغير. يمكن أن يؤدي هذا إلى تحسينات كبيرة في الدقة. مقارنة جنبًا إلى جنب بين الفحص المجهري الفلوري متعدد الأبعاد والفحص المجهري متحد البؤر لنفس العينة السميكة. عندما يتم التقاط سلسلة من الصور في مستويات بؤرية مختلفة، يمكن إنشاء صور يشار إليها عادة باسم "z-stacks"، والتي توضح مكاسب الدقة والتباين التي يوفرها الفحص المجهري متحد البؤر والأسباب الكامنة وراء هذه المكاسب. يمكن أن نرى أن فحص الصورة في الجزء العلوي من المكدس مع مستوى التصوير فوق الأنسجة يكشف عن كمية كبيرة من الضوء المتناثر في الصورة الفلورية، في حين تظهر الصورة المجهرية متحد البؤر باللون الأسود. يؤدي هذا التخفيض في PSF المحوري بشكل مباشر إلى اختلاف الدقة الملحوظ في الواجهة البصرية في منتصف المكدس z.
تم تحسين الدقة بشكل كبير مقارنة بإضاءة Widefield
في المجهر الفلوري، يتم وصف شدة الضوء المنبعثة من نقطة واحدة بواسطة وظيفة انتشار النقطة (PSF)، ونمطها هو قرص هوائي. يمكن وصف دقة نظام التألق من خلال نصف قطر القرص الهوائي، والذي يمكن وصفه من خلال تحديد الفتحة العددية للعدسة الموضوعية والطول الموجي لضوء الإثارة
