كيف يختلف المجهر الفلوري عن الفحص المجهري التقليدي
لقد حاولت مؤخرًا صنع بعض المقاطع المجمدة من الفئران، والآن أحتاج إلى استخدام مجهر مضان لمعرفة ما إذا كان الفيروس الذي حقنته موجودًا في منطقة الدماغ المطلوبة. تحتاج بعض المبادئ الأساسية للفحص المجهري الفلوري إلى دراسة موجزة، وسأشاركها هنا أيضًا.
يستخدم المجهر الفلوري الضوء فوق البنفسجي كمصدر للضوء لإضاءة الكائن الذي يتم اختباره، مما يتسبب في انبعاث مصدر ضوء من الكائن، ثم مراقبة الكائن تحت المجهر. يستخدم بشكل أساسي لخلايا التألق المناعي، ويتكون من مصدر ضوء ونظام لوحة مرشح ونظام بصري لمراقبة صورة التألق للعينة من خلال تكبير العدسة العينية والعدسة الشيئية. دعونا نلقي نظرة على الفرق بين هذا المجهر الفلوري والمجهر الضوئي العادي.
1. من حيث طرق الإضاءة
تستخدم طريقة إضاءة المجهر الفلوري عمومًا طريقة الشعاع الساقط، مما يعني أنه يتم تسليط مصدر الضوء على عينة الاختبار من خلال العدسة الشيئية.
2. من حيث القرار
يستخدم المجهر الفلوري الضوء فوق البنفسجي كمصدر للضوء، مع طول موجي قصير نسبيًا ولكن دقة أعلى من المجاهر الضوئية العادية.
3. الاختلافات في الفلتر
يستخدم المجهر الفلوري مرشحين خاصين، أحدهما أمام مصدر الضوء لتصفية الضوء المرئي، والآخر بين الهدف والعدسة لتصفية الضوء فوق البنفسجي، والذي يمكن أن يحمي العينين.
المجهر الفلوري هو أيضًا نوع من المجهر الضوئي، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن الطول الموجي المثار بواسطة المجهر الفلوري قصير، مما يؤدي إلى اختلافات في هيكل واستخدام المجهر الفلوري والمجهر العادي. تتمتع معظم المجاهر الفلورية بوظيفة جيدة تتمثل في التقاط الضوء الضعيف، لذا فإن قدرتها على التصوير تكون جيدة أيضًا في ظل الفلورسنت الضعيف للغاية. بالإضافة إلى ذلك، مع التحسين المستمر للفحص المجهري الفلوري في السنوات الأخيرة، تم أيضًا تقليل الضوضاء بشكل كبير. ولذلك، يتم تطبيق المزيد والمزيد من المجاهر مضان.
المعرفة المتعلقة بالمجهر الفلوري ثنائي الفوتون
المبدأ الأساسي للإثارة ثنائية الفوتون هو أنه عند كثافة الفوتون العالية، يمكن لجزيئات الفلورسنت أن تمتص في نفس الوقت فوتونين طويلين الطول الموجي، وبعد فترة قصيرة مما يسمى بعمر الحالة المثارة، تنبعث فوتونًا أقصر طولًا موجيًا؛ وتأثيره مماثل لاستخدام فوتون بطول موجي يساوي نصف الطول الموجي الطويل لإثارة جزيئات الفلورسنت. يتطلب إثارة الفوتون كثافة فوتون عالية، ولتجنب إتلاف الخلايا، يتم استخدام ليزر نبضي مقفل عالي الطاقة في مجهر ثنائي الفوتون. يتمتع الليزر المنبعث من هذا النوع من الليزر بطاقة ذروة عالية ومتوسط طاقة منخفض، مع عرض نبضة يبلغ 100 فمتوثانية فقط وتردد يصل إلى 80 إلى 100 ميجا هرتز. عند استخدام هدف ذو فتحة عددية عالية لتركيز فوتونات الليزر النبضي، تكون كثافة الفوتون عند النقطة المحورية للهدف هي الأعلى، ولا يحدث الإثارة ثنائية الفوتون إلا عند النقطة المحورية للهدف. ولذلك، لا يتطلب المجهر ثنائي الفوتون ثقوب متحد البؤر، مما يحسن كفاءة الكشف عن الأسفار.
في ظاهرة التألق العامة، بسبب انخفاض كثافة الفوتون للإثارة، يمكن لجزيء الفلورسنت أن يمتص فوتونًا واحدًا فقط في نفس الوقت، ثم ينبعث فوتونًا فلوريًا واحدًا من خلال انتقال الإشعاع، وهو ما يسمى مضان الفوتون الفردي. بالنسبة لعملية إثارة التألق باستخدام الليزر كمصدر للضوء، قد تحدث ظواهر فلورية ثنائية الفوتون أو حتى متعددة الفوتون. في هذا الوقت، يكون مصدر ضوء الإثارة المستخدم عالي الكثافة، وتفي كثافة الفوتون بمتطلبات جزيئات الفلورسنت لامتصاص فوتونين في وقت واحد. في عملية استخدام الليزر النموذجي كمصدر للضوء المثير، لا تزال كثافة الفوتون غير كافية لتوليد ظاهرة امتصاص فوتونين. عادة، يتم استخدام ليزر نبض الفيمتو ثانية، ويمكن أن تصل قوتها اللحظية إلى مستوى ميغاواط. لذلك، فإن الطول الموجي لفلورة ثنائية الفوتون أقصر من طول موجة الإثارة، وهو ما يعادل التأثير الناتج عن إثارة نصف طول موجة الإثارة.
