المجهر الفلوري يختلف عن المجهر التقليدي
تستخدم المجاهر الفلورية الضوء فوق البنفسجي كمصدر للضوء لتسليط الضوء على الجسم المراد فحصه، بحيث ينبعث الضوء من الجسم، ثم يتم مراقبة الجسم تحت المجهر. وهي تستخدم أساسا للخلايا المناعية. يتكون بشكل أساسي من مصدر ضوء ونظام لوحة مرشح ونظام بصري لمراقبة الصورة الفلورية للعينة من خلال تكبير العدسة العينية والعدسة الشيئية. دعونا نلقي نظرة على الفرق بين هذا المجهر الفلوري والمجهر الضوئي العادي.
1. انظر إلى طريقة الإضاءة
إن طريقة إضاءة المجهر الفلوري هي بشكل عام ظاهري، أي أنه يتم تسليط مصدر الضوء على عينة الاختبار من خلال العدسة الموضوعية.
2. انظر إلى القرار
تستخدم المجاهر الفلورية الضوء فوق البنفسجي كمصدر للضوء، والطول الموجي قصير نسبيًا، ولكن الدقة أعلى من تلك الموجودة في المجاهر الضوئية العادية.
3. الفرق في الفلتر
تستخدم المجاهر الفلورية مرشحين خاصين، يتم استخدامهما أمام مصدر الضوء لتصفية الضوء المرئي، ويستخدمان بين العدسة الشيئية والعدسة العينية لتصفية الأشعة فوق البنفسجية، والتي يمكن أن تحمي عيون الإنسان.
المجهر الفلوري هو أيضًا نوع من المجهر الضوئي، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن الطول الموجي المثار بواسطة المجهر الفلوري قصير، لذلك يؤدي هذا إلى اختلاف في البنية والاستخدام بين المجهر الفلوري والمجهر العادي. تتمتع معظم المجاهر الفلورية بوظيفة جيدة في التقاط الضوء الضعيف، لذلك في ظل الفلورسنت الضعيف للغاية، تكون قدرتها على التصوير جيدة أيضًا. إلى جانب التحسين المستمر للمجاهر الفلورية في السنوات الأخيرة، تم أيضًا تقليل الضوضاء بشكل كبير. ولذلك يتم استخدام المزيد والمزيد من المجاهر مضان.
زوج
المعرفة حول مجهر مضان الفوتون
المبدأ الأساسي للإثارة ثنائية الفوتون هو: في حالة كثافة الفوتون العالية، يمكن لجزيئات الفلورسنت أن تمتص فوتونين طويلي الطول الموجي في نفس الوقت، وتنبعث منها فوتونًا بطول موجي أقصر بعد فترة قصيرة تسمى عمر الحالة المثارة؛ التأثير هو نفسه استخدام فوتون بطول موجي نصف الطول الموجي الطويل لإثارة جزيئات الفلورسنت. تتطلب الإثارة ثنائية الفوتون كثافة فوتون عالية. من أجل عدم إتلاف الخلايا، يستخدم الفحص المجهري ثنائي الفوتون أشعة ليزر نبضية ذات وضع مغلق عالي الطاقة. يتمتع الليزر المنبعث من هذا الليزر بطاقة ذروة عالية ومتوسط طاقة منخفض، ويبلغ عرض نبضه 100 فمتوثانية فقط، ويمكن أن يصل تردده إلى 80 إلى 100 ميجا هرتز. عند استخدام عدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية لتركيز فوتونات الليزر النبضي، تكون كثافة الفوتون عند النقطة البؤرية للعدسة الموضوعية هي الأعلى، وتحدث الإثارة ثنائية الفوتون فقط عند النقطة البؤرية للعدسة الموضوعية، وبالتالي فإن لا يتطلب المجهر ثنائي الفوتون ثقبًا متحد البؤر، مما يحسن كفاءة الكشف عن التألق.
في ظاهرة التألق العامة، نظرًا لانخفاض كثافة الفوتون في ضوء الإثارة، يمكن لجزيء الفلورسنت أن يمتص فوتونًا واحدًا فقط في نفس الوقت، ثم ينبعث فوتونًا فلوريًا من خلال انتقال إشعاعي، وهو مضان أحادي الفوتون. بالنسبة لعملية إثارة التألق باستخدام الليزر كمصدر للضوء، قد يحدث تألق ثنائي الفوتون أو حتى متعدد الفوتون. في هذا الوقت، تكون شدة مصدر ضوء الإثارة المستخدم عالية، وتلبي كثافة الفوتون متطلبات جزيئات الفلورسنت التي تمتص فوتونين في نفس الوقت. في عملية استخدام الليزر العام كمصدر للضوء المثير، لا تزال كثافة الفوتون غير كافية لإنتاج ظاهرة امتصاص الفوتون. عادة، يتم استخدام ليزر نبضي بالفيمتو ثانية، ويمكن أن تصل قوته اللحظية إلى ميغاوات. ولذلك، فإن الطول الموجي للفلورة ثنائية الفوتون أقصر من الطول الموجي لضوء الإثارة، وهو ما يعادل التأثير الناتج عن الإثارة عند نصف الطول الموجي للإثارة.
يتميز المجهر الفلوري ثنائي الفوتون بالعديد من المزايا:
1) يكون الضوء ذو الطول الموجي الطويل أقل تأثراً بالتشتت من الضوء ذو الطول الموجي القصير ويخترق العينة بسهولة؛
2) لا يتم تحفيز جزيئات الفلورسنت خارج المستوى البؤري، بحيث يمكن أن يصل المزيد من ضوء الإثارة إلى المستوى البؤري، بحيث يمكن لضوء الإثارة اختراق عينات أعمق؛
3) الضوء ذو الطول الموجي الطويل القريب من الأشعة تحت الحمراء أقل سمية للخلايا من الضوء ذو الطول الموجي القصير؛
4) عند استخدام مجهر ثنائي الفوتون لمراقبة العينات، يحدث التبييض الضوئي والسمية الضوئية فقط في المستوى البؤري. لذلك، يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون أكثر ملاءمة من الفحص المجهري أحادي الفوتون لمراقبة العينات السميكة، أو لمراقبة الخلايا الحية، أو لتجارب التبييض الضوئي الموضعي.
المعرفة حول المجهر مضان متحد البؤر
المبدأ الأساسي للمجهر الفلوري متحد البؤر: يتم تشعيع العينة بمصدر ضوء نقطي، ويتم تشكيل بقعة ضوئية صغيرة محددة جيدًا على المستوى البؤري. بعد تشعيع النقطة، يتم جمع التألق المنبعث بواسطة العدسة الموضوعية وإرساله مرة أخرى إلى مقسم الشعاع المكون من مرآة مزدوجة اللون على طول مسار الإضاءة الأصلي. يرسل مقسم الشعاع الفلورة مباشرة إلى الكاشف. يوجد ثقب أمام مصدر الضوء والكاشف، ويسمى على التوالي ثقب الإضاءة وثقب الكشف. الحجم الهندسي للاثنين هو نفسه، حوالي 100-200 نانومتر؛ بالنسبة إلى نقطة الضوء على المستوى البؤري، فإن الاثنين مترافقان، أي أن بقعة الضوء تمر عبر سلسلة من العدسات، وأخيرًا يمكن التركيز على ثقب الإضاءة وثقب الكشف في نفس الوقت. وبهذه الطريقة، يمكن أن يتقارب الضوء الصادر من المستوى البؤري داخل نطاق فتحة الكشف، بينما يتم حجب الضوء المتناثر من أعلى أو أسفل المستوى البؤري خارج فتحة الكشف ولا يمكن تصويره. يقوم الليزر بمسح العينة نقطة بنقطة، ويحصل أنبوب المضاعف الضوئي بعد اكتشاف الثقب أيضًا على صورة متحد البؤر لنقطة الضوء المقابلة نقطة بنقطة، والتي يتم تحويلها إلى إشارة رقمية وإرسالها إلى الكمبيوتر، ويتم تجميعها أخيرًا في صورة واضحة صورة متحد البؤر للمستوى البؤري بأكمله على الشاشة.
كل صورة مستوى بؤري هي في الواقع مقطع عرضي بصري للعينة، وهذا المقطع العرضي البصري دائمًا ما يكون له سُمك معين، يُعرف أيضًا باسم المقطع البصري الرقيق. نظرًا لأن شدة الضوء عند النقطة البؤرية أكبر بكثير من تلك الموجودة عند النقطة غير البؤرية، ويتم ترشيح ضوء المستوى غير البؤري بواسطة الثقب، فإن عمق مجال النظام متحد البؤر يكون تقريبًا صفرًا، والمسح على طول يمكن للمحور Z تحقيق التصوير المقطعي البصري، وتشكيل شريحة بصرية ثنائية الأبعاد في البقعة المركزة للعينة التي سيتم ملاحظتها. من خلال الجمع بين مسح مستوى XY (المستوى البؤري) ومسح المحور Z (المحور البصري)، يمكن الحصول على الصورة ثلاثية الأبعاد للعينة من خلال تجميع صور ثنائية الأبعاد للطبقات المستمرة ومعالجتها بواسطة برامج كمبيوتر خاصة.
وهذا يعني أن ثقب الكشف وثقب مصدر الضوء يركزان دائمًا على نفس النقطة، بحيث لا يتمكن التألق المتحمس خارج المستوى البؤري من الدخول إلى ثقب الكشف.
التعبير البسيط عن مبدأ عمل متحد البؤر الليزر هو أنه يستخدم ضوء الليزر كمصدر للضوء. على أساس التصوير المجهري الفلوري التقليدي، فإنه يضيف جهاز مسح ليزر وجهاز تركيز مترافق، وهو نظام للحصول على الصور الرقمية ومعالجتها من خلال التحكم بالكمبيوتر.
