العد المباشر للكائنات الحية الدقيقة باستخدام المجهر
المبدأ التجريبي
يعد العد المباشر تحت المجهر باستخدام مقياس الكريات طريقة شائعة الاستخدام للعد الميكروبي. وميزة هذه الطريقة هي أنها بديهية وسريعة. ضع المعلق البكتيري المخفف بشكل مناسب (أو معلق البوغ) في غرفة العد بين الشريحة وغطاء زجاجي لجهاز قياس الكريات، وقم بالعد تحت المجهر. نظرًا لأن حجم غرفة العد ثابت (0.1mm2)، فيمكن تحويله إلى العدد الإجمالي للكائنات الحية الدقيقة لكل وحدة حجم وفقًا لعدد الكائنات الحية الدقيقة التي تمت ملاحظتها تحت المجهر. نظرًا لأن هذه الطريقة تحسب مجموع البكتيريا الحية والميتة، فإنها تسمى أيضًا طريقة العد الكلي للبكتيريا.
عادةً ما يكون مقياس الكريات الدموية عبارة عن شريحة زجاجية خاصة تشكل فيها أربعة أخاديد ثلاث منصات. تنقسم المنصة الموجودة في المنتصف إلى نصفين بواسطة أخدود أفقي قصير. شبكة محفورة على المنصة من كل جانب. وتنقسم كل شبكة إلى تسعة مربعات كبيرة. المربع الكبير في المنتصف هو غرفة العد. يتم عد الكائنات الحية الدقيقة في غرفة العد. يظهر هيكل لوحة عد خلايا الدم في الشكل Ⅷ-1.
يحتوي حجم غرفة العد بشكل عام على خاصيتين، أحدهما هو أن المربع الكبير مقسم إلى 16 مربعًا متوسطًا، وكل مربع متوسط مقسم إلى 25 مربعًا صغيرًا (الشكل Ⅷ-2)؛ والآخر مربع كبير. ينقسم المربع إلى 25 مربعًا وسطيًا، وكل مربع وسط مقسم إلى 16 مربعًا صغيرًا (الشكل Ⅷ-1, C). لكن بغض النظر عن نوع لوحة العد، فإن عدد المربعات الصغيرة في كل مربع كبير هو نفسه، أي 16×25=400 مربع صغير، كما هو موضح في الشكل Ⅷ-2.
طول ضلع كل مربع كبير 1 مم، ومساحة كل مربع كبير 1 مم2. بعد تغطية زجاج الغطاء، يكون الارتفاع بين زجاج الشريحة وزجاج الغطاء 0.1 مم، وبالتالي يكون حجم غرفة العد 0.1mm3.
عند العد، عادةً ما يتم حساب العدد الإجمالي للبكتيريا في الشبكات الخمس الوسطى، ثم الحصول على متوسط قيمة كل شبكة وسطية، ثم ضربها في 16 أو 25 للحصول على العدد الإجمالي للبكتيريا في شبكة كبيرة، ثم تحويلها إلى العدد الإجمالي للبكتيريا في 1 مل من المحلول البكتيري.
معدات المختبرات
عدادة الكريات، المجهر، ساترة، شعرية معقمة؛
المواد التجريبية
تعليق خميرة الخمر
الإجراء التجريبي (طريقة العد المباشر بالمجهر الميكروبي)
1. التخفيف
تمييع تعليق Saccharomyces cerevisiae بشكل صحيح. إذا لم يكن المحلول البكتيري سميكًا، فلا حاجة إلى تخفيفه.
2. غرفة العد المجهري
قبل إضافة العينات، قم بإجراء فحص مجهري لغرفة العد بلوحة العد. إذا كان هناك أوساخ، فيجب تنظيفها قبل العد.
3. إضافة عينة
قم بتغطية طبق مقياس الكريات النظيف والجاف بغطاء زجاجي، ثم استخدم قطارة معقمة ذات فم رفيع لإسقاط قطرة صغيرة من محلول Saccharomyces cerevisiae المخفف من حافة زجاج الغطاء (ليس كثيرًا)، بحيث يتحلل محلول البكتيريا. قريب من الفجوة على طول الفجوة. يدخل التناضح الشعري إلى غرفة العد من تلقاء نفسه، ويمكن ملء غرفة العد العامة بالسائل البكتيري. يجب الحرص على عدم وجود فقاعات الهواء.
4. العد المجهري
بعد الراحة لمدة 5 دقائق، ضع مقياس الكريات على مسرح المجهر، واستخدم أولاً عدسة منخفضة الطاقة للعثور على موقع غرفة العد، ثم قم بالتبديل إلى عدسة عالية الطاقة للعد. إذا وجد أن المحلول البكتيري سميك جدًا أو رقيق جدًا قبل العد، فمن الضروري إعادة ضبط التخفيف قبل العد. بشكل عام، يتطلب تخفيف العينة حوالي 5-10 من البكتيريا في كل خلية. تختار كل غرفة عد البكتيريا الموجودة في 5 شبكات متوسطة (4 زوايا اختيارية وشبكات مركزية) للعد. عادةً ما يتم حساب البكتيريا الموجودة على خط الشبكة فقط على الخطين العلوي واليمنى. في حالة تبرعم الخميرة، عندما يصل حجم جسم البرعم إلى نصف الخلية الأم، يتم عد اثنين من البكتيريا. عد عينة لحساب المحتوى البكتيري للعينة من القيم المحسوبة في غرفتي العد.
5. تنظيف عدادة الكريات
بعد الاستخدام، اشطف لوحة عد خلايا الدم الموجودة على الصنبور بنفثات الماء، ولا تغسلها بأشياء صلبة، وجففها بنفسك أو بمجفف الشعر بعد الغسيل. بالفحص المجهري يتم ملاحظة ما إذا كان هناك بقايا بكتيريا أو رواسب أخرى في كل خلية. وإذا لم يكن نظيفاً فيجب غسله مراراً حتى يصبح نظيفاً.
