الفرق بين المجهر العادي ومجهر الإسفار
تستخدم مجاهر الإسفار الضوء فوق البنفسجي كمصدر للضوء لإشعاع الجسم المراد فحصه ، بحيث يصدر الكائن الضوء ، ثم مراقبة الجسم تحت المجهر. وهي تستخدم أساسا لخلايا التألق المناعي. وهي تتكون أساسًا من مصدر ضوء ونظام لوحة مرشح ونظام بصري لمراقبة الصورة الفلورية للعينة من خلال تكبير العدسة العينية والعدسة الموضوعية. دعونا نلقي نظرة على الفرق بين هذا المجهر الضوئي والمجهر الضوئي العادي.
1. من حيث طرق الإضاءة
طريقة الإضاءة لمجهر التألق هي بشكل عام أسقفي ، أي يتم عرض مصدر الضوء على عينة الاختبار من خلال العدسة الموضوعية.
2. من حيث القرار
تستخدم مجاهر الإسفار الضوء فوق البنفسجي كمصدر للضوء. الطول الموجي قصير نسبيًا ، لكن الدقة أعلى من تلك الخاصة بالمجاهر الضوئية العادية.
3. الفرق في التصفية
يستخدم مجهر التألق مرشحين خاصين ، يستخدمان أمام مصدر الضوء لتصفية الضوء المرئي ، ويستخدمان بين العدسة الموضوعية والعينية لتصفية الضوء فوق البنفسجي ، والذي يمكن أن يحمي العين البشرية.
يعتبر مجهر الإسفار أيضًا نوعًا من المجهر الضوئي ، ويرجع ذلك أساسًا إلى قصر الطول الموجي المثار بواسطة المجهر الفلوري ، لذلك يؤدي هذا إلى اختلاف البنية والاستخدام بين مجهر التألق والمجهر العادي. معظم مجاهر الفلورة لها وظيفة جيدة في التقاط ضوء ضعيف ، لذلك في ظل التألق الضعيف للغاية ، تكون قدرتها على التصوير جيدة أيضًا. إلى جانب التحسين المستمر للمجاهر الفلورية في السنوات الأخيرة ، تم أيضًا تقليل الضوضاء بشكل كبير. لذلك يتم استخدام المزيد والمزيد من المجاهر الفلورية.
المعرفة حول الفحص المجهري ثنائي الفوتون
المبدأ الأساسي للإثارة ثنائية الفوتون هو: في حالة كثافة الفوتون العالية ، يمكن للجزيئات الفلورية أن تمتص فوتونين بطول موجة طويلة في نفس الوقت ، وتصدر فوتونًا بطول موجي أقصر بعد فترة قصيرة مما يسمى بعمر الحالة المثير. . ؛ التأثير مماثل لاستخدام فوتون طوله الموجي نصف الطول الموجي الطويل لإثارة جزيء الفلورسنت. تتطلب الإثارة ثنائية الفوتون كثافة عالية من الفوتون. من أجل عدم إتلاف الخلايا ، يستخدم الفحص المجهري ثنائي الفوتون أشعة الليزر النبضية ذات الطاقة العالية. يحتوي الليزر المنبعث من هذا الليزر على ذروة عالية للطاقة ومتوسط طاقة منخفض ، وعرض النبضة لا يتجاوز 100 فمتوثانية ، ويمكن أن يصل تردده إلى 80 إلى 100 ميغا هرتز. عند استخدام عدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية لتركيز فوتونات الليزر النبضي ، تكون كثافة الفوتون عند النقطة المحورية للعدسة الموضوعية هي الأعلى ، والإثارة ثنائية الفوتون تحدث فقط عند النقطة المحورية للعدسة الشيئية ، لذلك لا يحتاج المجهر ثنائي الفوتون إلى ثقب متحد البؤر ، مما يحسن من كفاءة الكشف عن الإسفار.
في ظواهر الفلورة العامة ، بسبب كثافة الفوتون المنخفضة لضوء الإثارة ، يمكن للجزيء الفلوري أن يمتص فوتونًا واحدًا فقط في نفس الوقت ، ثم يصدر فوتونًا مضيئًا من خلال انتقال إشعاعي ، وهو تألق فوتون واحد. بالنسبة لعملية الإثارة الفلورية باستخدام الليزر كمصدر للضوء ، قد يحدث مضان ثنائي الفوتون أو حتى متعدد الفوتونات. في هذا الوقت ، تكون شدة مصدر ضوء الإثارة المستخدم عالية ، وتفي كثافة الفوتون بمتطلبات جزيئات الفلورسنت التي تمتص فوتونين في نفس الوقت. في عملية استخدام الليزر العام كمصدر للضوء المثير ، لا تزال كثافة الفوتون غير كافية لإنتاج ظاهرة امتصاص الفوتونين. عادة ، يتم استخدام ليزر نبضي فيمتوثانية ، ويمكن أن تصل قوته اللحظية إلى حد ميغاواط. لذلك ، فإن الطول الموجي للفلورة ثنائية الفوتون هو أقصر من الطول الموجي لضوء الإثارة ، وهو ما يعادل التأثير الناتج عن الإثارة عند نصف طول موجة الإثارة.
يتميز الفحص المجهري ثنائي الفوتون بالعديد من المزايا:
1) الضوء ذو الطول الموجي الطويل أقل تأثراً بالانتثار من الضوء قصير الموجة ويخترق العينة بسهولة ؛
2) جزيئات الفلورسنت خارج المستوى البؤري ليست متحمسة ، بحيث يمكن أن يصل المزيد من ضوء الإثارة إلى المستوى البؤري ، بحيث يمكن لضوء الإثارة اختراق عينات أعمق ؛
3) الضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء ذو الطول الموجي الطويل أقل سمية للخلايا من الضوء قصير الموجة ؛
4) عند استخدام مجهر ثنائي الفوتون لمراقبة العينات ، يحدث التبييض الضوئي والسمية الضوئية فقط في المستوى البؤري. لذلك ، يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون أكثر ملاءمة من الفحص المجهري للفوتون الفردي لمراقبة العينات السميكة ، أو لمراقبة الخلايا الحية ، أو لتجارب تبييض الصور الموضعية.
المعرفة حول الفحص المجهري متحد البؤر مضان
المبدأ الأساسي للفحص المجهري متحد البؤر: يتم استخدام مصدر ضوء نقطي لإشعاع العينة ، ويتم تشكيل بقعة ضوئية صغيرة محددة جيدًا على المستوى البؤري. تتكون من مقسمات. يرسل مقسم الحزمة الفلورة مباشرة إلى الكاشف. يوجد ثقب أمام مصدر الضوء والكاشف ، يسمى على التوالي ثقب الإضاءة وثقب الكشف. الحجم الهندسي للاثنين هو نفسه ، حوالي 100-200 نانومتر ؛ بالنسبة إلى بقعة الضوء على المستوى البؤري ، فإن الاثنين مترافقان ، أي أن بقعة الضوء تمر عبر سلسلة من العدسات ، وأخيراً يمكن التركيز على ثقب الإضاءة وثقب الكشف في نفس الوقت. بهذه الطريقة ، يمكن أن يتقارب الضوء من المستوى البؤري في نطاق فتحة الكشف ، بينما يتم حظر الضوء المتناثر من أعلى أو أسفل المستوى البؤري خارج فتحة الكشف ولا يمكن تصويره. يقوم الليزر بمسح نقطة العينة بنقطة ، ويحصل الأنبوب المضاعف الضوئي بعد اكتشاف الثقب أيضًا على الصورة البؤرية لنقطة الضوء المقابلة نقطة بنقطة ، والتي يتم تحويلها إلى إشارة رقمية ونقلها إلى الكمبيوتر ، وفي النهاية يتم تجميعها في شكل واضح. صورة متحد البؤر للمستوى البؤري بأكمله على الشاشة.
كل صورة مستوى بؤري هي في الواقع مقطع عرضي بصري للعينة. هذا المقطع العرضي البصري دائمًا ما يكون له سمك معين ، يُعرف أيضًا باسم المقطع الرقيق البصري. نظرًا لأن شدة الضوء عند النقطة البؤرية أكبر بكثير من تلك الموجودة في نقطة عدم التركيز ، ويتم ترشيح ضوء المستوى غير البؤري بواسطة الثقب ، فإن عمق مجال النظام البؤري يكون صفرًا تقريبًا ، والمسح الضوئي على طول Z -يمكن للمحور أن يحقق التصوير المقطعي البصري ، ويشكل مراقبة القسم البصري ثنائي الأبعاد في البقعة المركزة للعينة. من خلال الجمع بين مسح المستوى XY (المستوى البؤري) ومسح المحور Z (المحور البصري) ، يمكن الحصول على الصورة ثلاثية الأبعاد للعينة من خلال تجميع صور ثنائية الأبعاد للطبقات المستمرة ومعالجتها بواسطة برنامج كمبيوتر خاص.
وهذا يعني أن ثقب الكشف وثقب مصدر الضوء دائمًا ما يركزان على نفس النقطة ، بحيث لا يمكن أن يدخل التألق المتحمس خارج المستوى البؤري إلى ثقب الكشف.
التعبير البسيط لمبدأ عمل الليزر المتحد البؤر هو أنه يستخدم الليزر كمصدر للضوء ، وعلى أساس التصوير المجهري الفلوري التقليدي ، يضيف جهاز مسح ليزري وجهاز تركيز مقترن ، وهو نظام لاكتساب الصور الرقمية و المعالجة من خلال التحكم في الكمبيوتر.
