تحديد عدد الكائنات الحية الدقيقة - طريقة العد المباشر للمجهر!
يتجلى النمو السكاني البكتيري من خلال زيادة عدد الخلايا أو زيادة الكتلة الخلوية. تشمل طرق تحديد عدد الخلايا طريقة العد المجهر المباشر ، وطريقة عد مستعمرة الصفائح ، وطريقة نسبة الزيت الكهروضوئي ، وطريقة الاحتمال القصوى ، وطريقة الترشيح الغشائي. تشمل طرق قياس المادة الخلوية تحديد الوزن الجاف للخلية ، وتحديد مكونات خلوية معينة مثل محتوى النيتروجين والحمض النووي الريبي والحمض النووي ، وتحديد المستقلبات. باختصار ، هناك العديد من الطرق لقياس نمو الكائنات الحية الدقيقة ، لكل منها مزاياها وعيوبها ، ويجب اختيارها وفقًا للحالة المحددة. تقدم هذه التجربة بشكل أساسي طريقة العد المباشر المجهر المستخدمة بشكل شائع في الإنتاج والبحث العلمي.
1. متطلبات الغرض
1. توضيح مبدأ تعداد خلايا الدم.
2. إتقان طريقة عد الكائنات الحية الدقيقة باستخدام عداد خلايا الدم.
2. المبادئ الأساسية
طريقة العد المباشر بالميكروسكوب هي طريقة بسيطة وسريعة وبديهية لحساب كمية صغيرة من تعليق العينة ليتم اختبارها على شريحة زجاجية خاصة بمنطقة وحجم معينين (يُعرف أيضًا باسم عداد البكتيريا). طُرق. في الوقت الحاضر ، عدادات البكتيريا شائعة الاستخدام في الداخل والخارج هي: لوحة عد خلايا الدم ، عداد بكتيريا Peteroff-Hauser وعداد بكتيريا Hawksley ، إلخ. يمكن استخدامها لحساب الخميرة والبكتيريا وجراثيم العفن وغيرها من المعلقات ، و المبدأ الأساسي هو نفسه. يبلغ الحجم الإجمالي للنوعين الأخيرين من عدادات البكتيريا 0. 0 2 مم 3 بعد تغطيتها بزجاج غطاء ، والمسافة بين زجاج الغطاء والشريحة 0.02 مم فقط ، وبالتالي فإن الزيت يمكن استخدام العدسة الموضوعية الغاطسة لرصد ومراقبة الخلايا الصغيرة مثل البكتيريا. عدد. بالإضافة إلى مقاييس البكتيريا هذه ، هناك أيضًا طريقة تقدير لنسبة مساحة اللطاخة إلى منطقة المجال البصري التي يتم ملاحظتها مباشرة تحت المجهر ، والتي تُستخدم عمومًا للفحص البكتيريولوجي للحليب. مزايا طريقة العد المباشر المجهر بديهية وسريعة وسهلة التشغيل. ومع ذلك ، فإن عيب هذه الطريقة هو أن النتيجة المقاسة عادة ما تكون مجموع الخلايا الحية والميتة. في الوقت الحاضر ، هناك بعض الطرق للتغلب على هذا القصور ، مثل الجمع بين البكتيريا القابلة للحياة التي تلطيخ ثقافة الغرفة الصغيرة (وقت قصير) وإضافة مثبطات انقسام الخلايا لتحقيق الغرض من عد البكتيريا القابلة للحياة فقط.
في هذه التجربة ، تم استخدام مقياس الهيموسيتومتر كمثال للعد المجهري المباشر. لاستخدام النوعين الآخرين من عدادات البكتيريا ، يرجى الرجوع إلى تعليمات كل مصنع. يعد العد مباشرة تحت المجهر باستخدام مقياس الهيموسيتومتر طريقة شائعة الاستخدام لعد الكائنات الحية الدقيقة. لوحة العد عبارة عن شريحة زجاجية خاصة ، تتكون من ثلاث منصات بأربع فتحات ؛ المنصة الأوسع في المنتصف مقسمة إلى نصفين بواسطة فتحة عرضية قصيرة ، وهناك شبكة على كل جانب من جوانب المنصة. كل شبكة مقسمة إلى تسعة مربعات كبيرة ، والمربع الكبير في المنتصف هو غرفة العد. يظهر هيكل لوحة تعداد خلايا الدم في الشكل 1 {{{1 0}}}. مقياس غرفة العد بشكل عام له نوعان من المواصفات ، الأول هو مربع كبير مقسم إلى 25 مربعًا متوسطًا ، وكل مربع متوسط مقسم إلى 16 مربعًا صغيرًا (الشكل 15-2) ؛ والآخر مربع كبير. ينقسم المربع إلى 16 مربعًا متوسطًا ، وكل مربع متوسط مقسم إلى 25 مربعًا صغيرًا ، ولكن بغض النظر عن نوع لوحة العد ، هناك 400 مربع صغير في كل مربع كبير. يبلغ طول ضلع كل مربع كبير 1 مم ، ومساحة كل مربع كبير 1 مم 2. بعد التغطية بزجاج الغلاف ، يكون الارتفاع بين زجاج الغطاء والزجاج المنزلق 0.1 مم ، وبالتالي فإن حجم غرفة العد هو 0.lmm3 (ألف من المليلتر). شكل 15-1 هيكل لوحة عد خلايا الدم (1) شكل 15-2 هيكل لوحة عد خلايا الدم (2) أ. منظر أمامي ؛ عرض المقطع الطولي. الشبكة الموسعة ، المربع الكبير في الوسط هو غرفة العد 1. لوحة عد خلايا الدم ؛ 2. غطاء زجاجي. 3. عند العد في غرفة العد ، عادةً ما تحسب العدد الإجمالي للبكتيريا في خمسة مربعات ، ثم احسب متوسط كل مربع ، واضرب في 25 أو 16 للحصول على العدد الإجمالي للبكتيريا في مربع كبير ثم يتم تحويلها إلى العدد الإجمالي للبكتيريا في 1 مل من المحلول البكتيري. اجعل العدد الإجمالي للبكتيريا في المربعات الخمسة هو أ ، ونسبة التخفيف للمحلول البكتيري هي ب. إذا كانت لوحة عد مكونة من 25 مربعًا ، فإن العدد الإجمالي للبكتيريا في 1 مل من المحلول البكتيري {{26} } أ / 5 × 25 × 104 × ب =50000 أ · ب (قطع) بالمثل ، إذا كانت لوحة عد بها 16 مربعًا متوسطًا ، فإن العدد الإجمالي للبكتيريا في المحلول البكتيري 1 مل=أ / 5 × 16 × 104 × ب =32000 أ · ب (قطع)
3. المعدات
1. البكتيريا
خميرة الخميرة
2. الآلات أو الأواني الأخرى
مقياس هيموسيتومتر ، مجهر ، ساترة ، قطارة شعيرية معقمة.
4. خطوات التشغيل
1. تحضير تعليق جرثومي
تم تحضير Saccharomyces cerevisiae في معلق بكتيري بتركيز مناسب مع محلول ملحي فسيولوجي معقم.
2. غرفة عد المجهر
قبل إضافة العينات ، افحص غرفة العد في لوحة العد مجهريًا. إذا كان هناك أوساخ ، فيجب تنظيفها وتجفيفها قبل العد.
3. أضف عينة
قم بتغطية مقياس الكريات النظيف والجاف بغطاء ساترة ، ثم استخدم قطارة شعيرية معقمة لإسقاط قطرة صغيرة من تعليق Saccharomyces cerevisiae المهتز من حافة ساترة ، واترك الحل البكتيري يتحرك تلقائيًا على طول الفجوة بالتناضح الشعري. عند دخول غرفة العد ، يمكن ملء غرفة العد العامة بسائل بكتيري. عند أخذ العينات ، قم أولاً بهز المحلول البكتيري ؛ عند إضافة العينات ، لا ينبغي إنشاء فقاعات هواء في غرفة العد.
4. عد المجهر
بعد إضافة العينة ، قف ساكنًا لمدة 5 دقائق ، ثم ضع مقياس الهيموسيتومتر على مرحلة المجهر ، ابحث أولاً عن مكان غرفة العد باستخدام مجهر منخفض الطاقة ، ثم قم بالتبديل إلى مجهر عالي الطاقة للعد. اضبط شدة ضوء المجهر بشكل مناسب. بالنسبة للمجاهر التي تستخدم مرايا للإضاءة ، انتبه إلى عدم الانحراف عن جانب واحد من الضوء ، وإلا فلن يكون من السهل رؤية الخطوط المربعة لغرفة العد بوضوح في مجال الرؤية ، أو فقط الخطوط الرأسية أو الخطوط الأفقية يرى. إذا وجد أن المحلول البكتيري شديد التركيز أو مخفف جدًا قبل العد ، فمن الضروري إعادة ضبط التخفيف قبل العد. بشكل عام ، يتطلب تخفيف العينة حوالي 5 إلى 10 بكتيريا في كل خلية صغيرة. تحدد كل غرفة عد 5 خلايا وسطى (4 زوايا اختيارية وخلية وسطى واحدة في المركز) للعد. يتم حساب الخلايا الموجودة على خط الشبكة بشكل عام فقط في الخطين العلوي واليمين. في حالة تبرعم الخميرة ، عندما يصل حجم البرعم إلى نصف الخلية الأم ، يتم حسابها على أنها خليتان بكتيريتان. لحساب عينة ، احسب المحتوى البكتيري للعينة عن طريق حساب متوسط القيمة من غرفتي العد.
5. اغسل عدد خلايا الدم
بعد الاستخدام ، اشطف لوحة تعداد خلايا الدم بالماء في الصنبور ، ولا تفركها بأشياء صلبة ، وجففها بنفسك أو بمجفف شعر بعد الغسيل. الفحص المجهري لملاحظة ما إذا كانت هناك بكتيريا متبقية أو رواسب أخرى في كل خلية صغيرة. إذا لم تكن نظيفة ، فيجب غسلها بشكل متكرر حتى تصبح نظيفة.
