مقارنة بين المجهر متحد البؤر والمجهر الضوئي العادي
المجهر الضوئي العام
يتكون المجهر البيولوجي العام من ثلاثة أجزاء، وهي: ① نظام الإضاءة، بما في ذلك مصدر الضوء والمكثف؛ ② نظام التضخيم البصري، الذي يتكون من عدسة موضوعية وعدسة عينية، هو الجسم الرئيسي للمجهر. من أجل القضاء على الانحراف الكروي والانحراف اللوني، تتكون كل من العدسة العينية والعدسة الشيئية من مجموعات عدسات معقدة؛ (3) جهاز ميكانيكي يستخدم لتثبيت المواد والمراقبة المريحة.
ما إذا كانت الصورة المجهرية واضحة أم لا لا يعتمد فقط على التكبير، ولكن أيضًا على دقة المجهر. تشير الدقة إلى قدرة المجهر (أو المكان الذي تكون فيه عيون الإنسان على بعد 25 سم من الهدف) على تمييز الفاصل الزمني الصغير للكائن zui. تعتمد الدقة على الطول الموجي للضوء ونسبة الفتحة ومعامل انكسار الوسط، والتي يتم التعبير عنها بالصيغة:
R=0.61lect /N．A． N．A．＝ｎsin /2
حيث: n= معامل انكسار للوسط؛=زاوية المرآة (زاوية فتح العينة لفتحة العدسة)، والفتحة الرقمية NA=. زاوية المرآة دائما أقل من 180؟ لذلك، يجب أن تكون قيمة zui لـ sina/2 أقل من 1.
معامل انكسار الزجاج المستخدم لصنع العدسات البصرية هو 1.65~1.78، ومعامل انكسار الوسط المستخدم أقرب إلى معامل انكسار الزجاج، كلما كان ذلك أفضل. بالنسبة للعدسة الموضوعية الجافة، يكون الوسط هو الهواء، ونسبة الفتحة بشكل عام 0.05 ~ 0.95؛ تستخدم العدسة الزيتية الإسفلت العطري كوسيط، ويمكن أن يكون معدل فتح العدسة قريبًا من 1.5.
الطول الموجي للضوء العادي هو 400~700 نانومتر، لذا فإن دقة المجهر لا تقل عن 0.2 ميكرومتر، ودقة العين البشرية 0.2 مم، وبالتالي فإن التكبير الكبير لـ zui مصمم بواسطة المجهر العام عادة ما يكون 1000Xx.
لماذا تحتاج إلى مجهر متحد البؤر؟
1. لقد تم تحسين المجهر الضوئي من خلال جهود وتحسين أسلافنا العظماء. في الواقع، يمكن للمجاهر العادية أن تزودنا بصور مجهرية جميلة ببساطة وبسرعة. ومع ذلك، حدث حدث جلب الابتكار الثوري إلى عالم المجهر المثالي تقريبًا، وهو اختراع "المجهر البؤري المسح بالليزر". ويتميز هذا المجهر الجديد باعتماد نظام بصري يقوم فقط باستخراج معلومات الصورة على المستوى الذي يتركز فيه التركيز، واستعادة المعلومات التي تم الحصول عليها في ذاكرة الصورة مع تغيير التركيز، بحيث تكون صورة حية بمعلومات كاملة ثلاثية الأبعاد يمكن الحصول عليها. وبهذه الطريقة، يمكن ببساطة الحصول على معلومات حول شكل السطح والتي لا يمكن تأكيدها بواسطة المجاهر العادية. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للمجاهر الضوئية العادية، يعد "تحسين الدقة" و"تعميق عمق التركيز" شرطين متناقضين، خاصة عند التكبير العالي، ولكن بالنسبة للمجاهر متحد البؤر، تم حل هذه المشكلة.
2. مزايا النظام البصري متحد البؤر
يضيء النظام البصري متحد البؤر نقطة العينة، ويتم استقبال الضوء المنعكس أيضًا بواسطة مستقبلات النقطة. عندما يتم وضع العينة في موضع التركيز، يمكن أن يصل كل الضوء المنعكس تقريبًا إلى المستقبل الضوئي، ولكن عندما تنحرف العينة عن التركيز، لا يمكن للضوء المنعكس أن يصل إلى المستقبل الضوئي. وهذا يعني أنه في النظام البصري متحد البؤر، سيتم إخراج الصورة التي تتزامن مع التركيز فقط، وسيتم حماية العين والضوء المتناثر عديم الفائدة.
3. لماذا نستخدم الليزر؟
في النظام البصري متحد البؤر، يتم إضاءة العينة ويتم استقبال الضوء المنعكس أيضًا بواسطة مستقبل ضوئي نقطي. لذلك، يصبح مصدر الضوء النقطي ضروريا. ينتمي الليزر إلى مصدر ضوء نقطي للغاية. في معظم الحالات، يعتمد مصدر ضوء المجهر متحد البؤر مصدر ضوء الليزر. بالإضافة إلى ذلك، فإن خصائص الليزر، مثل أحادية اللون والاتجاهية وشكل الشعاع الممتاز، تعد أيضًا من الأسباب المهمة لاستخدامه على نطاق واسع.
4. المراقبة في الوقت الحقيقي على أساس المسح عالي السرعة تصبح ممكنة.
في المسح بالليزر، يتم استخدام العاكس البصري الصوتي (العنصر الرئيسي AO) في الاتجاه الأفقي ويتم استخدام مرآة Servo Galvano في الاتجاه الرأسي. نظرًا لعدم وجود جزء اهتزاز ميكانيكي في وحدة الانحراف البصري الصوتي، يمكنها المسح بسرعة عالية، ومن الممكن المراقبة في الوقت الفعلي على شاشة المراقبة. تعد السرعة العالية لهذه الكاميرا مشروعًا مهمًا جدًا يؤثر بشكل مباشر على سرعة التركيز واسترجاع الموضع.
5. العلاقة بين موضع التركيز والسطوع
في النظام البصري متحد البؤر، عندما يتم وضع العينة بشكل صحيح في موضع التركيز، يكون السطوع كبيرًا، وقبل ذلك وبعده، سينخفض سطوعه بشكل حاد (خط متصل في الشكل 4). هذه الانتقائية الحساسة للمستوى البؤري هي أيضًا مبدأ قياس اتجاه ارتفاع المجهر متحد البؤر وتوسيع العمق البؤري. في المقابل، لا يحتوي المجهر الضوئي العادي على تغيير واضح في السطوع قبل وبعد موضع التركيز (الخط المنقط في الشكل 4).
6. التباين العالي والدقة العالية
في المجهر الضوئي العام، سوف يتداخل الضوء المنعكس المنحرف عن التركيز، وسوف يتداخل مع جزء تصوير التركيز، وبالتالي تقليل تباين الصورة. في المقابل، في النظام البصري متحد البؤر، تتم إزالة الضوء المتناثر خارج التركيز والضوء المتناثر داخل العدسة الشيئية بالكامل تقريبًا، لذلك يمكن الحصول على صورة ذات تباين عالٍ جدًا. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن الضوء يمر عبر العدسة الشيئية مرتين، يتم زيادة حدة الصورة النقطية أولاً، كما يتم تحسين دقة المجهر أيضًا.
7. وظيفة التعريب البصري
في النظام البصري متحد البؤر، يتم حماية الضوء المنعكس للجزء الآخر غير النقطة البؤرية بواسطة المسام الصغيرة. ولذلك، عند مراقبة عينة ثلاثية الأبعاد، يتم تشكيل صورة مثل تلك التي تشكلت بعد تقطيع العينة مع التركيز (الشكل 5). ويسمى هذا التأثير بالتوطين البصري، وهو ينتمي إلى أحد تخصصات النظام البصري متحد البؤر.
8. التركيز على وظيفة الذاكرة المتحركة
ما يسمى بالضوء المنعكس خارج التركيز محمي بواسطة المسام الصغيرة. ومن ناحية أخرى، يمكن اعتبار أن جميع النقاط الموجودة في الصورة المتكونة بواسطة النظام البصري متحد البؤر تتزامن مع التركيز. لذلك، إذا تم نقل العينة ثلاثية الأبعاد على طول اتجاه المحور Z (المحور البصري)، فسيتم تجميع الصورة وتخزينها في الذاكرة، وسيحصل zui في النهاية على الصورة التي تم تشكيلها من خلال مصادفة العينة بأكملها والتركيز . بهذه الطريقة، تسمى وظيفة عمق التركيز اللانهائي وظيفة الذاكرة المتنقلة.
9. وظيفة قياس شكل السطح
في وظيفة نقل التركيز، يمكن قياس شكل سطح العينة بطريقة غير متصلة عن طريق إضافة حلقة تسجيل الارتفاع. بناءً على هذه الوظيفة، من الممكن تسجيل إحداثيات المحور Z المتكونة من قيمة السطوع الكبيرة لـ zui في كل بكسل، وبناءً على هذه المعلومات، يمكن الحصول على المعلومات المتعلقة بالشكل السطحي للعينة.
10. وظيفة قياس صغيرة الحجم عالية الدقة
تعتمد وحدة استقبال الضوء مستشعر تصوير CCD أحادي البعد، لذلك لا يمكن أن يتأثر بإمالة المسح لجهاز المسح، لذلك يمكن إكمال القياس عالي الدقة. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن وظيفة ذاكرة نقل التركيز البؤري مع عمق التركيز البؤري القابل للتعديل يتم اعتمادها في نفس الوقت، فيمكن إزالة خطأ القياس الناتج عن إزاحة التركيز البؤري.
11. تحليل الصور ثلاثية الأبعاد
باستخدام وظيفة قياس شكل السطح، يمكن بسهولة إنشاء صورة ثلاثية الأبعاد لسطح العينة. ليس هذا فحسب، بل يمكن أيضًا إجراء العديد من أنواع التحليل، مثل: قياس خشونة السطح، المساحة، الحجم، مساحة السطح، الدائرية، نصف القطر، طول زوي، المحيط، مركز الثقل، الصورة المقطعية، تحويل FFT، الخط قياس العرض وهكذا.
يمكن استخدام مجهر المسح متحد البؤر بالليزر ليس فقط لمراقبة مورفولوجيا الخلية، ولكن أيضًا للتحليل الكمي للمكونات الكيميائية الحيوية في الخلايا، وإحصائيات الكثافة البصرية وقياس مورفولوجيا الخلية.
